также Химотрипсин

Для возбуждения спектров КР используют обычно излучение в видимой области. При этом спектры КР также находятся в видимой области, что позволяет использовать для их записи стеклянную оптику. Поскольку вода прозрачна для видимого света и очень слабо рассеивает его, она служит прекрасным растворителем для получения спектров КР- При этом доступны для исследования многие водные растворы, интересные с биологической точки зрения, для которых использование метода ИК-спектроскопии затруднительно или даже невозможно. Примером могут служить растворы а-химотрипсина и других ферментов, в спектрах КР котор были обнаружены полосы, характерные для ряда структурных элементов в этих молекулах. [c.222]

Среда активного центра отличается, как правило, сильно развитой микрогетерогенностью. Это связано с тем, что в образовании поверхностного слоя белков принимают участие не только заряженные и полярные аминокислотные остатки (которым, поскольку они сильно сольватированы, термодинамически выгодно контактировать с водой), но также частично и аполярные (углеводородные) боковые группы. Так, например, для а-химотрипсина методом рентгеноструктурного анализа [c.20]

Представление о конформационной подвижности активного центра при взаимодействии его с субстратом не противоречит современным рентгеноструктурным данным, которые в литературе начали трактовать так, как если бы химотрипсин имел исключительно жесткое строение [18]. В этой связи следует учесть, что разрешение кристаллографического метода не превышает 2 А. В то же время Кошланд мл. и сотр. [124] (см. также [125]) полагают, что высокая эффективность катализа может быть достигнута лишь в том случае, если точность [c.156]

В реакциях, катализируемых а-химотрипсином, изменение ионной силы раствора также оказывает влияние лишь на эффективную константу скорости ацилирования фермента (/гг ) [14]. Это было использовано для раздельного определения индивидуальных констант в реакциях гидролиза ряда сложноэфирных субстратов с помощью соотношений (6.123)—(6.125) [15], как это показано на рис. 96. [c.245]

Серин и треонин входят в состав большинства белков, оксилизин найден только в склеропротеинах, например, в коллагене. Оксигруппа серина и треонина обладает, по-видимому, специфическими свойствами. Так, в фосфопротеидах фосфорная кислота связывается с белком через гидроксильную группу этих аминокислот, а также оксигруппы тирозина и оксипролина Активность ряда ферментов — химотрипсина, трипсина, Холинэстеразы связывают с оксигруппой серина [c.470]

Для разрушения пептидной части гликопротеинов широко применяется протеолиз, особенно часто под действием проназы (обычно из 81гер1от св5 г15тч), которая является набором мощных протеиназ, способных разрушать пептидные цепи, устойчивые к другим протеолитиче-ским ферментам. Часто употребляются также трипсин, химотрипсин, па-паин. Гидролизат, полученный после обработки протеиназами, подвергают фракционированию с применением диализа, гель-фильтрации и хроматографии (см., например, ), выделяя один или несколько низкомолекулярных гликопептидов, структуру которых устанавливают обычными методами и иногда подтверждают встречным синтезом. Впервые гидролиз гликопротеина трипсином был применен Нейбергером для выделения фрагмента овальбумина, содержащего узел связи олигосахаридной и пептидной части молекулы в дальнейшем для этой же цели использовали также химотрипсин, пепсин и другие фepмeнты " . . Протеолиз проназой очень широко применялся при выделении узловых фрагментов из 7-глобулина , тиреоглобулина фибриногена и особенно му- [c.571]

Помимо эффекта сближения и эффекта ориентации следует учитывать также третий фактор — стерическое сжатие. Тем не менее эти факторы не объясняют повыщення констант скорости реакций ио крайней мере еще в 10 —10 раз. Среди возможных объяснений следует упомянуть электростатическую стабилизацию переходного состояния и снятие напряжения в основном состоянии. Следует учесть и такой фактор, указанный Бендером, как замораживание субстратной специфичности . Примером этого служит ароматическая полость в, а-химотрипсине (см. ниже), создающая благоприятную стерическую ситуацию для боковой цепи аминокислоты субстрата. [c.215]

Исследовались также свойства а-химотрипсина, метилированного по Н15-57, для объяснения механизма действия этого фермента. Метилированный а-химотрипсин примерно в 10 раз активнее а-химотрипсина [99]. Результаты исследований говорят о том, что общеосновной катализ остается составной частью механизма гидролиза модифицированным ферментом. [c.230]

Субтнлизин, сериновая протеаза бактериального происхождения, также проявляет, подобно а-химотрипсину, обращенную специфичность к D-K TI [103]. Это предполагает, что оба фермента обладают сходной специфичностью к конфигурации их субстратов. Такая общая специфичность ясно подтверждает близкую структурную аналогию первичных связывающих центров обоих ферментов, и, более того, она отражает эту аналогию. Близкая структурная аналогия объясняет, каким образом а-химотрипсин и субтилизин, имеющие абсолютно разное филогенетическое происхождение, в действительности замораживают свои субстраты в одинаковой активной конформации. [c.234]

Как уже упоминалось, существует значительная перекрестная специфичность для а-химотрипсина, папаина и субтилизииа. Результаты подобных исследований хиральной специфичности, видимо, прольют свет на новые аспекты эволюционной дивергенции протеаз млекопитающих, бактерий и животных. Кроме того, активация зимогена, как правило, — это промежуточный этап как в биосинтезе протеаз, так и в самых разнообразных биологических процессах, например коагуляция крови, комплементарные реакции, выработка гормонов, фибриполпз и т. д. Такой точный и ограниченный протеолиз ферментами с широкой первичной специфичностью также показывает решающую важность третичной структурной специфичности протеаз в их взаимодействиях с природными субстратами [107]. [c.238]

Было показано, что синтетические сополимеры также проявляют каталитические эффекты, сравнимые с ферментативным катализом. С целью ныяснения возможности кооперативного взаимодействия имидазольной и гидроксильной групп получен сополимер винил-имидазола и винилового спирта. Он напоминает фермент а-химотрипсин. Однако сополимер лишь немногим более активен, чем поливинилимидазол в реакциях гидролиза эфиров. [c.298]

Наиболее важная информация о строении молекулы химотрипсина (молекулярная масса 25 ООО) была получена с помощью рентгеност-зуктурных исследований последних лет, проведенных Блоу с сотр. 14, 17—19]. Как итог своих исследований авторы представили трехмерную модель молекулы химотрипсина (см. рис. 3). В согласии с ранними общими представлениями о строении белков было найдено, что все заряженные группы в молекуле этого фермента направлены в сторону водного растворителя (за исключением трех, которые выполняют специфические функции либо в механизме активации зимогена, либо в механизме действия активного центра). Особенности расположения аминокислотных остатков с гидрофобными боковыми цепями внутри белковой глобулы также согласуются с ранними представлениями о важной роли гидрофобных взаимодействий в стабилизации третичной структуры белков (см. гл. I). [c.127]

Рентгеновские исследования комплексов химотрипсина с субстратоподобными ингибиторами сыграли принципиальную роль в установлении структурных предпосылок каталитической функции его активного центра (см. 2 этой главы). Однако для выяснения динамических аспектов действия активного центра оказались особенно плодотворными подходы химической кинетики (см. 5,6 этой главы). Успехи кинетических исследований были во многом предопределены открытием М. Бергмана и Д. Фрутона и позднее Г. Нейрата и их сотрудников, которые установили, что химотрипсин способен гидролизовать не только сложные белковые молекулы, но также и простые низкомолекулярные синтетические субстраты (амиды, сложные эфиры и др.) [20]. [c.127]

Специфичность к среде. Химотрипсин реагирует в водной среде (реакционную способность обнаруживают также и влажные его кристаллы [40]). В неводных растворителях (например, в диметилсульфо-- [c.131]

Специфический вклад, который в понижение свободной энергии активации вносит сорбция на ферменте а-ациламидной группы субстрата, можно оценить также и по другому, если сравнить реакционные способности по отношению к химотрипсину для производного а-М-аце-тилфенилаланина [c.136]

З-образный характер зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в катализе химотрипсином. Изменение среды в результате добавки органических соединений также оказывает заметное влияние на эффективность сорбции на активном центре химотрипсина гидрофобных компонентов реакции. Причина этого заключается, как правило, в том, что органическая добавка, повышая растворимость субстрата (или субстратоподобного ингибитора) в воде, удерживает его в водном растворе и затрудняет тем самым [c.145]

Те же закономерности характеризуют также и кинетику гидролиза химотрипсином специфических аминокислотных субстратов как на стадии ацилирования, так деацилирования [21, 113]. Пространственное взаимоотношение сорбционной и каталитической областей в активном центре нашло отражение также и в эффективности комплексообразования с химотрипсином бифункциональных ингибиторов, алкил- и фенилалкилборных кислот [114, 115]. [c.150]

Гидрофобное фермент-субстратное взаимодействие вносит важный вклад в специфичность химотрипсинового катализа (см. 2, 4, 5 этой главы). Это связано с тем, что составной нукЛеофил, входящий в активный центр фермента и принимающий участие в атаке сорбированной молекулы субстрата, расположен в поверхностном слое белковой глобулы [17—19, 66, 67]. Реакции, катализируемые химотрипсином, протекают таким образом вблизи поверхности раздела фаз вода — белок и сопровождаются термодинамически выгодным переносом (полным или частичным) гидрофобных фрагментов молекулы субстрата из одной среды (вода) в другую (белок). Свсбодная энергия такого рода гидрофобного взаимодействия, сопровождающего химическую реакцию между ферментом и субстратом, зависит от структуры субстрата, а также от геометрической конгруэнтности ее по отношению к активному центру (см. 5 этой главы). [c.150]

В согласии с механизмом (4.40) субстратоподобный ингибитор действительно вытесняет из активного центра несколько молекул воды, как это было обнаружено при рентгеноструктурном анализе кристаллического химотрипсина [123]. Однако этот механизм не согласуется с данными по влиянию среды на гидрофобное фермент-субстратное взаимодействие (см. 4 этой главы). Кроме того, механизм (4.40) противоречит тому, что двойной выигрыш свободной энергии экстракции реализуется лишь в переходном состоянии химической реакции [см. уравнение (4.39)], в то время как в комплексе Михаэлиса вклад гидрофобного фермент-субстратного взаимодействия меньше [см. уравнение (4.29)]. Иными словами, в химотрипсиновом катализе не вся потенциальная свободная энергия сорбции, которую предполагает модель (4.40), равная 2АСэкстр, реализуется в виде прочного связывания субстрата с ферментом. Из диаграммы, представленной на рис. 44, видно, что в комплексе Михаэлиса (или ацилферменте) реализуется в виде свободной энергии связывания E-R лишь инкремент свободной энергии сорбции, отражающий перенос субстрата из воды в неводное окружение (в среду белковой глобулы), равный АО кстр [см. также уравнение (4.29)]. Для объяснения этих фактов следует допустить, что гидрофобное фермент-субстратное взаимодействие идет в две стадии 1) образование фермент-субстратного комплекса протекает по механизму (4.19), который не противоречит данным по солевому эффекту (на их основании он был и предложен), и термодинамические закономерности его согласуются с уравнением (4.29). Этот механизм также предполагает вытеснение нескольких молекул воды из [c.155]

В последнее время работами Хесса с сотрудниками [5—7] на примере а-химотрипсина был развит новый метод изучения кинетики начальных стадий ферментативных реакций, получивший название метода вытеснения профлавина . Метод основан на том факте, что краситель профлавин (3,6-диаминоакридин) при связывании с а-химотрипсином в водном растворе изменяет свой спектр поглощения в ультрафиолетовой области. Величина разностного спектра поглощения, имеющего максимальное значение при длине волны 465 нм, пропорциональна -концентрации комплекса фермент-профлавин. Введение в систему фермент-профлавин субстрата, конкурирующего с красителем за связывание на активном центре а-химотрипсина, приводит к двум последовательным процессам вытеснения профлавина. Первый, очень быстрый процесс, заключается в обратимом вытеснении красителя из комплекса его с ферментом за счет образования нековалентного фермент-субстратного комплекса. Второй процесс, времена прохождения которого лежат обычно в пределах разрешения установок типа остановленной струи , вызван химическим взаимодействием субстрата с ферментом (например, образованием ацилферментного промежуточного соединения), что приводит к дополнительному уменьшению концентрации комплекса фермент-профлавин. Изучение кинетики второго процесса при различных концентрациях субстрата в дополнение к изучению кинетики ферментативной реакции в стационарном режиме позволяет сделать заключения о стадийности изучаемой реакции, а также найти значения констант скоростей промежуточных стадий ферментативной реакции. [c.188]

Биоспецифическая хроматография применяется для очистки ферментов, так как она позволяв извлекать ферменты из сложных смесей в одну стадию с высокой степенью очистки и с большим выходом. В последнее время в качестве адсорбентов-носителей в биоспецифической хроматографии находят применение как макропористые неорганические адсорбенты (силикагели, силохромы, пористые стекла), так и макропористые органические сшитые сополимеры, например макропористые сополимеры глицидилме-такрилата с этилендиметакрилатом типа сферой (см. лекцию 6) со сферическими зернами разных размеров. Эти адсорбенты-носители обладают разной удельной поверхностью и крупными порами разных размеров. На рис. 18.10 представлен пример биоспецифической хроматографии химотрипсина на сфероне с иммобилизованным химической прививкой белком — ингибитором трипсина (являющегося также ингибитором химотрипсина). Из колонны, заполненной обычным макропористым сфероном без иммобилизованного ингибитора, химотрипсин выходит вместе с остальными белками, а из колонны, заполненной сфероном с привитым ингибитором, сопутствующие белки выходят приблизительно за то же время, а химотрипсин прочно удерживается. Это позволяет отделить [c.342]

У простых ферментов активные центры образуются за счет своеобразного расположения аминокислотных остатков в структуре белковой молекулы. К таким аминокислотным остаткам следует отнести 5Н-группы цистеина ОН-группы серина — МН-группы кольца имидазола в гистидине, а также некоторое значение придается карбоксильным группам аспарагиновой и глутаминовой аминокислот, индольной группе триптофана и др. Хотя вопрос о природе и механизме действия активных центров представляет большой интерес, но, к сожалению, наши сведения об этом являются пока ограниченными. Выяснено, что количество активных центров в ферментах, как правило, очень ограничено так, например, большинство ферментов имеют от 1 (трипсин, химотрипсин, карбокси-полипептидаза и др.) до 3—4 (уреаза) активных центров, и только отдельные ферменты содержат их в больших количествах (от 20 до 100 содержится в холинэстеразе и др.). [c.106]

К физическим факторам могут быть отнесены температурный—нагревание растворов выше 50—60° С многократное чередование замораживания и оттаивания денатурация под высоким давлением в 1000 кг/см и выше так, напрнмер, ферменты трипсин и химотрипсин при pH 5,0—5,2 под воздействием давления 7750 кг см через 5 мин инактивируются на 50% денатурация при воздействии ультразвуковых волн связана с разворачиванием молекул, а при более сильном воздействии ультразвука происходит даже paзpyшefIi e ковалентных связей при образовании мономолекулярных пленок на поверхности белковых растворов наблюдается так называемая поверхностная денатурация белка ультрафиолетовые лучи и ионизирующая радиация вызывают химические говреждеиия белковой молекулы, разрушая водородные связи, окисляя дисульфидные группировки, обусловливают исчезновение нативных третичных и вторичных структур белка. Интересными также являются наблюдения, указывающие на процессы денатурации, происходящие при старении белков. [c.209]

Единственная химическая реакция, которая здесь будет рассматриваться, —это гидролиз. Он может осуществляться как ферментативным, так и химическим путем. Горячая разбавленная минеральная кислота медленно расщепляет амидные связи с образованием с учайных фрагментов, в конечном итоге приводя к простым аминокислотам. Контролируемый кислотный гидролиз разрушает белок с образованием смеси пептидов. Возможен также ферментативный гидролиз протеолитические ферменты очень разнообразны по своему специфическому действию. Некоторые из них, такие, как папаин или фицин, фактически неспецифичны и расщепляют белки до свободных аминокислот, в то время как другие — трипсин, химотрипсин и пепсин— гидролизуют только особые связи в белковых молекулах (ср. мальтаза, эмульсин и т. д., разд. 17.6 и 17.7). Так, пепсин расщепляет амидную связь между карбоксильной группой ди-карбоновой ь-аминокислоты и аминогруппой ароматической ь-аминокислоты при условии, что вторая карбоксильная кислотная группа дикарбоновой аминокислоты не связана. Химотрипсин менее специфичен и расщепляет амидную связь с карбонильной стороны ароматической ь-аминокислоты. Трипсин гидролизует амидные связи, включающие карбоксильные груп- [c.296]

Трипсин и химотрипсин, очевидно, имеют второй активный центр, содержап ий гистидин. Второй участок удален от первого, но на спиральной цепочке они сближены. Установление активной роли гистидина основывалось частично на изменении скорости ферментативной реакции в зависимости от pH, что соответствовало предположению о стратегическом расположении слабоосновного остатка, имеющего характер гистидина. Даже сам имидазол также катализирует гидролиз простейших сложных эфиров (БрюИ С" и Шм Ир 1965—.19i57 Бендер, 1957). 7 о, что фермент в 10 раз эффективнее, чем имидазол, имеет аналогию в модельных опытах по мутаротации глюкозы — реакции, катализируемой кислотами и основаниями. о -Оксипиридин, содержащий кислотный и основной центры (оба относительно слабые), более эффективен как катализатор, чем смесь пиридина и фенола (Свайн, 1952). И в а-окси-пиридине, и в протеолитическнх ферментах бифункциональность повышает каталитическую активность, поскольку протоны могут быть одновременно поданы и отщеплены в сопряженной реакции. Механизм действия, предложенный, Нейратом (1957) для химотрипсина, сводится к следующему. При взаимодействии гидроксильной группы серина с имидазольным кольцом гистидина отщепляется протон и образуется активированный комплекс П, имеющий электрофильный и нуклеофильный центры. [c.714]

ПРОНАЗА, смесь частично очищенных протеолитич ферментов из микробов 31гер1отусе5 gri.seus, содержащая нейтр. и щел. протеиназы (см. Протеолитгтеские ферменты), а также протеиназы, близкие по характеру действия химотрипсину и карбоксипептидазам. Мол. м. компонентов 16 000—20 ООО. Обладает широкой субстратно специфичностью, при pH 7—8 гидролизует в казеине и альбумине 80—85% пептидных связей. Активность разл. комнонентов П. подавляется хелатами, диизопропилфторфосфатом, хлоркетонами. Активизируется Са +, Со +, Мп +, Примен. при исследовании строения белков ПРОПАЗИН. триазин [c.480]

Биосинтез И млекопитающих кодируется одним геном (у нек-рых видов-двумя), определяющим образование одноцепочечного крупного белка - предшественника проинсулина (мол. м. ок. 9000), из к-рого после ферментативного расщепления образуется гормон. В организме И. гидролизуется протеолитич ферментами (трипсином, химотрипсином, пепсином), тканевыми протеазами и пептидазами, а также ферментом печени инсулиназой. [c.242]

Остаток L- . встречается во всех организмах в составе молекул белков, особенно много их в фиброине шелка остаток С. входит также в молекулу фосфатидилсерина. Активность ряда ферментов (трипсин, химотрипсин, холин-эстераза) связана со специфич. реакц. способностью гидроксигруппы остатка С., входящего в структуру их активных центров. [c.325]

Это должно привести к значительному увеличению положительного заряда атома углерода, что в свою очередь должно облегчить нуклеофильную атаку. Такое взаимодействие должно также стабилизировать тетраэдрическое промежуточное соединение [уравнение (7-13)]. Карбонильный кислород проявляет очень слабую основность, но он может прото-нироваться подходящим образом ориентированной кислотной группой фермента [НВ в уравнении 7-16)]. В сериновых протеиназах эта функция, очевидно, выполняется двумя ЫН-группами амидных связей, одна из которых в химотрипсине принадлежит остатку 5ег-195 (рис. 7-2). По-видимому, подгонка субстрата к полости оксианиона между двумя NH-гpyппaми хорошо выполняется только для тетраэдрического промежуточного соединения [33]. [c.111]

Куль и сотр. [356] и Мартинек и сотр. [356а] исследовали катализируемое ферментами образование пептидной связи в двухфазных водноорганических системах. Преимущество такой методики состоит в том, что функционирующая как катализатор протеаза не повреждается органическим растворителем, что гарантирует более высокие выходы, кроме того, можно вернуть обратно биокатализатор после разделения фаз. Далее Кй-нек и сотр. [386] впервые провели успешные пептидные синтезы с иммобилизованным химотрипсином. Наряду с иммобилизованными ферментами можно также использовать ферменты, адсорбционно фиксированные на силикагеле, что было продемонстрировано на примере синтеза пептидов с помощью химотрипсина, фиксированного на силикагеле [443]. [c.169]

Химотрипсин преимущественно расщепляет те пептидные связи, карбоксильная функция которых относится к ароматическим аминокислотам. В длинных полипептидных цепях гидролизуются также связи, образованные лейцииом, валином, аспарагином и метионином. Пепсин обладает слабо выраженной специфичностью. Расщепляются связи, образованные триптофаном, фенилаланином, тирозином, метионином и лейцином. [c.365]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология