Бактериофаги как векторы III

Эукариотические вирусы до сих пор нашли более скромное применение в качестве векторов. Практически используются только онкогенный вирус SV 40 и его производные. Все эти векторы — дефектные вирусы, не способные давать полноценные вирусные частицы в клетке хозяина. Анализируемую ДНК можно вводить и в другие репликоны, способные размножаться в клетках, например бактериофаги. Чаще всего из известных фагов в качестве векторов применяют сконструированные производные фага X и фагов М13 и fd. В векторах на основе бактериофага I. используется его особенность, состоящая в том, что большая часть его ДНК не участвует в размножении фага в клетке. Это позволяет вводить чужеродную ДНК в ДНК фага X в качестве вектора. [c.120]

Векторы на основе бактериофага Л С помощью плазмидных векторов можно клонировать фрагменты ДНК длиной до 10 т. п. н. Однако при создании геномных библиотек час- [c.71]

Чтобы иметь возможность клонировать целый ген, донорную ДНК расщепляют лишь частично. При этом получаются фрагменты разной длины, из которых затем создают геномную библиотеку. Для клонирования крупных фрагментов ДНК были сконструированы векторы на основе бактериофагов X и Р1, а также плазмиды Р. [c.78]

Рис. 5.16. Использование бактериофага М13 для клонирования и секвенирования. А. Встраивание фрагмента ДНК в двухцепочечную репликативную форму ДНК М13. Б. Секвенирование комплементарных цепей клонированного фрагмента ДНК с помощью одного и того же праймера (Р1). Стрелками показана ориентация вставки в векторе.

К сожалению, в результате ошибочного спаривания праймера заданной длины с более чем одним участком внутри вставки могут быть получены неоднозначные результаты. Чтобы избежать этого, используют праймеры длиной не менее 24 нуклеотидов и стараются строго соблюдать условия отжига. Именно таким образом были секвенированы фрагменты ДНК, клонированные в бактериофаге X (-20 т. п. н.) или в космидном векторе (-40 т. п. н.). [c.93]

Векторы, используемые в Е. соМ — плазмиды и бактериофаги [c.430]

Молекула вектора должна отвечать определенным требованиям быть небольшой, содержать уникальные участки расщепления рестрикционными эндонуклеазами, иметь маркеры для оптимальной селекции рекомбинантных клеток. В качестве векторов для включения чужеродной ДНК в клетки Е. соИ используются плазмиды (термин предложен Дж. Ледербергом) и бактериофаги. И те и другие являются репликонами. [c.430]

Клонирование при использовании в качестве векторов бактериофага А осуществляется следующим образом к суспензии бактерий, обработанных СаСЬ., добавляется ДНК фага и осуществляется посев на чашку Петри с питательным агаром так, чтобы на [c.435]

Рис. 1.8. Клонирование ДНК в векторе на основе бактериофага X,

Геном бактериофага X был превращен генными инженерами в наиболее удобный вектор для клонирования крупных фрагментов чужеродной ДНК. В геноме фага X есть два участка, не содержащие генов, необходимых для литического развития и производства потомства. Эти участки включают, соответственно, 22000 нуклеотидных пар в середине карты и 3000 между генами Р и Q (см. рис. 7.7). Таким образом, около [c.280]

Книга охватывает все таксоны бактерий и посвящена проблемам теоретической и прикладной бактериологии. Поскольку в природе преобладают сапрофитные формы, паразитические и патогенные бактерии отдельно не рассматриваются. Не обсуждаются также специальные методы прикладных областей микробиологии, равно как и не делается попытка охватить всю микробиологию. Вирусы упоминаются только в связи с бактериофагами, используемыми в качестве векторов в процессе переноса генов, водоросли — только в связи с цианобактериями (сине-зелеными водорослями) дрожжи, плесневые грибы и простейшие упоминаются лишь вскользь. [c.7]

Первая глава данного тома касается использования плаз-мидных векторов, имеющих в своем составе высокоспецифичные промоторы РНК-полимераз некоторых бактериофагов. Такие векторные молекулы позволяют получать радиоактивно меченные зонды, которые благодаря своим уникальным свойствам все шире применяются сейчас в исследованиях структуры и функций нуклеиновых кислот. Подобные системы на основе космидных векторов рассматриваются во второй главе. Эти векторы разработаны для того, чтобы сделать менее трудоемкими прогулки по хромосомам высших организмов. Фаговые промоторы здесь расположены таким образом, что синтезируемый радиоактивно меченный зонд соответствует концевой области клонированной ДНК, а это облегчает поиск клонов, содержащих перекрывающиеся сегменты ДНК. [c.8]

Вектор. Плазмида или бактериофаг, в которые может быть введена чужеродная ДНК с целью клонирования. [c.51]

После того как рекомбинантная ДНК сшита, ее вводят в живые клетки. Но поскольку она не способна к самовоспроизведению, ее разрушают внутриклеточные нуклеазы. Для того чтобы рекомбинантная ДНК стала составной частью генетического аппарата клетки, она должна либо встроиться (интегрироваться) в ее геном и реплицироваться за его счет, либо быть способной к автономной репликации. Принято молекулы ДНК, способные акцептировать чужеродную ДНК и автономно реплицироваться, называть векторными молекулами. К числу векторов относят плазмиды, бактериофаги, вирусы животных. Векторы должны обладать следующими особенностями [c.117]

Векторные системы, способные интегрировать крупные вставки (>100 т. п. н.), имеют большую ценность при анализе сложных эукариотических геномов. Без таких векторов не обойтись, например, при картировании генома человека или при идентификации отдельных генов. В отличие от библиотек с небольшими вставками, в геномной библиотеке с крупными вставками скорее всего будет представлен весь генетический материал организма. Кроме того, в этом случае уменьшается число клонов, которые нужно поддерживать, и увеличивается вероятность того, что каждый из генов будет присутствовать в своем клоне. Для клонирования фрагментов ДНК размером от 100 до 300 т. п. н. был сконструирован низкокопийный плазмидный вектор на основе бактериофага Р1 — химерная конструкция, называемая искусственной хромосомой на основе фага Р1. Был создан также очень стабильный вектор, способный интегрировать вставки длиной от 150 до 300 т. п. н., на основе Р-плазмиды (F-фактора, или фактора фертильности) Е. соИ, которая представлена в клетке одной или двумя копиями, с селекционной системой la Z векторов pU . Эта конструк- [c.76]

Амплифицированные кДНК обрабатывают специфическими рестрицирующими эндонуклеазами, а затем встраивают в вектор на основе бактериофага Х. кДНК Н- и L-цепей содержат разные, характерные для каждой из них эндонуклеазные сайты, что облегчает специфическое встраивание каждой нуклеотидной последовательности в свой вектор. На этом этапе происходит клонирование множества разных сегментов Н- и L-цепей (рис. 10.13, Ап Б). [c.218]

Векторы на основе бактериофага X не очень пригодны для получения больших количеств белковых молекул. Чтобы решить эту проблему, сконструировали такой вектор, в котором ДНК Н-и L-цепей встраиваются в сайт, фланкированный плазмидной ДНК. Такую плазмиду, содержащую ДНК Н- и L-цепи, можно вырезать из вектора и трансформировать ею Е. oli (рис. 10.12). Являясь частью плазмиды, ДНК Fv-фрагментов будет многократно реплицироваться в клетках Е. соИ с образованием большого количества продукта, который можно использовать как в диагностическгк, так и в терапевтических целях. [c.219]

Рис. 10.13. Сконструированные участки ДНК из комбинаторной библиотеки кДНК Fv-фрагмента, клонированные в бактериофаг а. А и Б. Фрагменты ДНК L-( ) и Н-( ) цепей раздельно встроили в векторы на основе бактериофага а. В. Провели рестрикцию каждой iT oRI-библиотеки и лигировали фрагменты ДНК из библиотеки Н-цепи с фрагментами ДНК из библиотеки L-цепи, в результате чего получили комбинаторную библиотеку, содержащую все возможные сочетания фрагментов L- и Н-цепей с экспрессией соединенного фрагмента в одном векторе. pLa - /ас-промотор Е. соН, ССР - сайт связывания с рибосомой.

Большое разнообразие векторов существует на основе бактериофага в них используется особенность фага, состоящая в том, что значительная часть его ДНК не нужиа для размножения фага в клетке (рнс. 249). Это позволяет вводить чужеродную ДНК в ДНК фага к при использовании его в качестве вектора, причем длина вставляемого фрагмента может быть существенно больше величины фрагмента, встраиваемого в плазмиду. [c.432]

Важную группу векторов, широко используемых прн установлении первичной структуры ДНК, составляют нитевидные бактериофаги, такие, как М13, fd и fl. Фаг М13 представляет собой одно-цепочечиую циклическую ДНК длиной около 6500 нуклеотидов. После инфицирования бактериальной клетки одноцепочечная ДНК фага превращается в двухцепочечную репликативную форму (RF), которая во всех отношениях подобна плазмиде. Кроме того, фаговая ДНК содержит короткий участок (500 нуклеотидов), названный межгенной последовательностью (МП), несущественный для ее жизнеспособности (рнс. 250). [c.432]

Поскольку транспозоны не способны к автономной репликации, для переноса их из одной бактериальной клетки в другую необходим так называемый вектор (переносчик). Векторами могут служить плазмиды или бактериофаги. Следует упомянуть, чТо колифаг мю ( фаг-мута-тор ), подобно транспозону, обладает способностью внедряться в различные участки бактериальной хромосомы и вызывать мутации. По этой причине фаг мю был назван гигантским транспозоном , и его используют в повседневной практике получения мутантов Е. oli. [c.447]

На основе бактериофага Я. были сконструированы векторы, в составе которых фрагменты чужеродной ДНК длиной до 22 т. н. п. весьма стабильны. При создании таких векторов для клонирования на основе фага А. учитывалось то обстоятельство, что вся центральная часть молекулы ДНК фага ( 19 т. н. п.) не нужна для репликации фага в Е. соИ. Эту область с помощью рестриктазы вырезают из генома фага так, что правый и левый концевые фрагменты (так называемые правое и левое плечо фага), необходимые для репликации, остаются неизменными. Плечи фага отделяют от остальных фрагментов и используют в качестве векторов для клонирования, содержащих на месте вырезанной фаговой ДНК вставку чужеродной ДНК размером около 9— 21 т. н. п. Размножаются в бактери-40 [c.40]

Описанный в гл. 19 метод клонирования чужеродных последовате ьностей в бактериофагах или плазмидах может быть использован и для встраивания генов в эукариотические вирусы. Путем внесения необходимых разрывов рестриктазами и последующего объединения полученных фрагментов глобиновый, инсулиновый и другие гены из множества источников были встроены в эукариотические вирусные векторы. Один из наиболее распространенных векторов-обезьяний вирус 8У-40, который может размножаться в клетках ряда млекопитающих. Новые гены могут быть встроены в область ранних или поздних генов транскрипционной единицы вируса. Их экспрессия включает стадию образования РНК-предше-ственника, на 5 -конце которого обычно имеются вирусные последовательности, за которыми следует последовательность встроенного гена. Такие РНК подвергаются нормальному сплайсингу, как показано на рис. 26.8. [c.325]

Смотреть страницы где упоминается термин Бактериофаги как векторы III: [c.104] [c.71] [c.74] [c.116] [c.149] [c.159] [c.218] [c.220] [c.231] [c.301] [c.441] [c.315] [c.319] [c.216] [c.230] [c.36] [c.315] [c.319] [c.336] [c.103] [c.40] [c.39] [c.40] [c.40]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология