РНК-полимеразы очистка

Гели с иммобилизованной ДНК применяют в качестве неподвижной фазы, например при гибридизации в агаре [126], при выделении кодирующей нити ДНК [127]. ДНК, связанную с различными носителями, можно использовать для очистки ДНКаз [122—130] или других ферментов, участвующих в метаболизме и биосинтезе ДНК (полимераз, лигаз и т. п.). [c.82]

АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ НА ГЕПАРИН-СЕФАРОЗЕ И КАЗЕИН-СЕФАРОЗЕ ДЛЯ ОЧИСТКИ И РАЗДЕЛЕНИЯ ДНК-ЗАВИСИМЫХ РНК-ПОЛИМЕРАЗ И ПРОТЕИНКИНАЗ [c.162]

Ниже описаны методы с использованием иммобилизованных гепарина и казеина для очистки и разделения двух классов РНК-полимераз и различных типов протеинкиназ. [c.163]

Таблица 10. Данные по очистке РНК-полимеразы и протеинкиназы

Использование гель-фильтрации для освобождения от радиоактивных предшественников неоднократно цитировалось при описании методов введения радиоактивной метки в белки и нуклеиновые кислоты [Остерман, 1983]. Нередко обессоливание используют и на заключительном этапе очистки для освобождения не только от соли, но и от прочих низкомолекулярных примесей. Например, в одной из работ по выделению РНК-полимеразы очисткой белка на биогеле А-1,5т завершалась целая серия операций, включавшая различные варианты переосаждений белка и ионообмениой хроматографии [Vaisius, Horgen, 1979]. [c.138]

П р и м е р 5. Очистка ДНК-полимеразы I из Е. oli [Rhodes et al., 1979]. На первых этапах здесь использовали грубую очистку осаждением полиэтиленимином и сульфатом аммония. Затем следовал этап хроматографической очистки на колонке фосфоцеллюлозы, уравновешенной 0,04 М К-фосфатным буфером (pH 6,9) с обычными добавками, включая 5% глицерина. Введение глицерина продиктовано лабильностью фермента — его активность снижается вдвое за сутки. Препарат вносили в том же буфере, им же промывали колонку, а затем вели элюцию линейным градиентом концентрации этого буфера (0,04—0,3 М). Таким образом, вытесняющий белок контрион (К+) поставлялся самим буфером. [c.304]

Пример 12. Очистка РНК-полимеразы II из илесени Aspergillus nidulans [Stunnenberg et al., 1981]. Мы преднамеренно выбрали работу, в которой объект очистки очень сходен с тем, что фигурировал в примере 10, для того чтобы подчеркнуть важность учета индивидуальных особенностей материала ири решении каждой конкретной хроматографической задачи. [c.307]

По своему существу аффинная хроматография — это особый тип адсорбционной хроматографии. В отличие от того, что было описано в гл. 6, адсорбция здесь осуществляется за счет биоспецифп-ческого взаимодействия между молекулами, закрепленными на матрице, т. е. связанными в неподвижной фазе, и комплементарными к ним молекулами, подлежащими очистке или фракционированию, поступающими, а затем элюируемыми с подвижной фазой. Биоспеци-фическое взаимодействие отличается исключительной избирательностью, а зачастую и очень высокой степенью сродства между партнерами. Оно лежит в основе множества строго детерминированных процессов, протекающих в организме. В качестве примеров можно назвать взаимодействия между ферментами и их субстратами, кофакторами или ингибиторами, между гормонами и их рецепторами, между антигенами и специфическими для них антителами, между нуклеиновыми кислотами и специфическими белками, связывающимися с ними в процессе осуществления своих функций (полимераза.мп, нуклеазами, гистонами, регуляторными белками), а также между самими нуклеиновыми кислотами-матрицами и продуктами их транскрипции. Наконец, многие малые молекулы (витамины, жирные кнслоты и др.) специфически связываются со специальными транспортными белками. [c.339]

Кислый аминополисахарид гепарин [М> 10 ООО) известен в качестве антикоагулянта крови. Кроме того, он применяется в биохимии как ингибитор рибонуклеаз. Это его качество, по-видимому-отражает некоторое сходство полимера, содержащего две-три суль, фогруппы на каждую дисахаридную структурную единицу, с РНК-Две эти особенности определили использование гепарина в качеств, лиганда для аффинной хроматографии факторов коагуляции крове и (особенно широко) для очистки белков, взаимодействующих и нуклеиновыми кислотами (полимераз, обратной транскриптазы, рес стриктаз, факторов инициации и элонгации белкового синтеза и др.). Кроме того, иммобилизованный гепарин связывает липопротеид-липазы и некоторые липопротеиды. Гепарин-агароза выпускается всеми упомянутыми фирмами-поставщиками аффинных сорбентов, кроме Bio-Rad . [c.370]

Помимо очистки мРНК п белков, связываюш ихся с ДНК, для олиго((1Т)-целлюлозы в последние годы открылась новая важная область применения — в качестве матрицы и затравки для полимераз и обратных транскриптаз, ведущих соответствующие комплементарные синтезы нуклеиновых кислот in itro. [c.373]

Пример 3. Очистка ДНК-полимеразы а из зародыша цыпленка [Yamagu hi et al., 1982]. Аффинной хроматографии здесь также предшествовали четыре стадии ионообменной хроматографии и гель-фильтрация. Сорбция фермента на голубой агарозе в этом [c.421]

Пример использования линейного концентрационного градиента соли для выделения РНК-полимеразы из Es heri hia oli на ДНК-агарозе [29] показан на рис. 10.9. Из фракции РНК-полимеразы, выделенной в результате предварительной стадии очистки хроматографией на биогеле А, неактивный материал отделяется аффинной хроматографией в виде первого пика, далее линейным [c.269]

ДНК-полимераза, или дупликаза, иными словами — ДНК-нуклеотидилтрансфераза (К. Ф., 2.7.7.7.), получена теперь в виде чрезвычайно чистого препарата [28, 97] из экстрактов Е. olt. Этот препарат однороден и не разделяется нри седиментации, хроматографии и электрофорезе на крахмальном геле. Очищенные препараты содержат нуклеазы, и только на последних этапах очистки от полимеразы удается отделить так называемую экзонуклеазу III (ДНК-фосфатаза-экзонуклеазу, стр. 95). Даже наиболее чистые препараты еще содержат некоторое количество экзонуклеазы II (стр. 94), причем соотношение между активно- [c.199]

В некоторых случаях возможна ферментативная полимеризация и в отсутствие добавляемого олиго- или полинуклеотида. Обычные препараты полинуклеотидфосфорилазы катализируют полимеризацию нуклеозиддифосфатов и без затравки или инициатора. Такая способность, однако, теряется при дальнейшей очистке фермента она связана, очевидно, с присутствием олигонуклеотидов в мало-очищенных ферментных препаратах. В некоторых условиях удается осуществить синтез полинуклеотидов без матрицы с ДНК- и РНК-полимеразами эти случаи будут рассмотрены ниже. [c.99]

Так как наша полимераза увеличивает количество фаговой РНК, то ее называют также репликазой, что приблизительно можно перевести как фермент размножения или фермент удвоения . Его очистка связана со значительными трудностями. Труднее всего оказалось очистить фермент от рибонуклеазы, которая имеет пренеприятное свойство загрязнять почти любой ферментный экстракт. Даже незначительная примесь рибонуклеазы немедленно привела бы к распаду либо собственной фаговой, либо новообразованной РНК. [c.397]

ДНК-зависимая ДНК-полимераза (К. Ф. 2. 7. 7. 7.) — ДНК-нуклеотидилтранс-фераза, или фермент Корнберга (ДНК-полимераза 1), осуществляющий полимеризацию дезоксирибонуклеозидтрифосфатов на ДНК-матрице в присутствий ионов Выделенный из кишечной палочки после тщательной очистки фермент представляет собой препарат, гомогенный по критериям седиментации, хроматографии и электрофореза в крахмальном геле. Наряду с полимеразной активностью фермент обладает также экзонуклеазной активностью. [c.50]

В системе in vitro используется классический подход проводят очистку всех компонентов и подбирают условия, при которых наблюдается правильная инициация. Правильная инициация определяется как процесс образования РНК, начинающийся в сайте, соответствующем 5 -концу мРНК. В последнее время появилась возможность осуществить это в отношении каждой из трех эукариотических РНК-полимераз. Имеющиеся системы характеризуются различной степенью очистки. В состав некоторых систем входят неочищенные клеточные экстракты, содержащие РНК-полимеразу, в других-фермент добавляют к клеточному экстракту. В дальнейшем эти системы должны быть заменены препаратами, содержащими все охарактеризованные компоненты, и тогда in vitro можно будет сравнивать активности РНК-полимераз из различных тканей и объектов. [c.149]

Эукариотические ДНК-полимеразы не обладают 3 -> -> 5 -экзонуклеазной активностью и обусловливают гораздо более высокую частоту возникновения ошибок при репликации ДНК фага фХ174 in vitro. При одинаковых условиях для эукариотических полимераз наблюдались следующие частоты 3-10 для ДНК-полимеразы а (Pol а), 1,2-3,0 -10 для ДНК-полимераз Р и у- Очевидно, что для обеспечения необходимой точности репликации в эукариотических клетках должны присутствовать дополнительные ферменты, повышающие точность этого процесса. Некоторые биохимические данные свидетельствуют о наличии у эукариот фермента с 3 -> 5 -экзонуклеазной активностью, действующего в контакте с ДНК-полимеразой а. Этот фермент может обеспечивать корректорскую функцию in vivo, утрачиваемую в ходе очистки ДНК-полимеразы а. [c.122]

Изучение генетического контроля утилизании лактозы в клетках Е. соИ привело исследователей к выводу о существовании белка-репрессора, который в отсутствие лактозы в среде выключает синтез Р-галактозидазы. Выделение, очистка этого белка и использование его в опытах in vitro позволили расшифровать механизм гакой регуляции. Оказалось, что репрессор ингибирует транскрипцию 1ас-оперона, связываясь с так называемым оператором - последовательностью ДПК длиной 21 нуклеотид, которая перекрывается с расположенным по соседству участком связывания РПК-полимеразы (промотором). До тех пор, пока репрессор [c.184]

Кровь представляет собой вязкую жидкость красного цвета со средней плотностью р = 1,057 г/см . Кровь состоит из межклеточного вещества — плазмы крови и взвешенных в ней форменных элементов эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов (рис. 1). Эритроциты человека представляют собой безъядерные клетки, утратившие в процессе фило— и онтогенеза ядро и большинство органелл, в том числе и митохондрии, и поэтому для молекулярно-генетического анализа эритроциты не представляют интереса. Тем не менее, содержащийся в них гемоглобин и продукты его деструкции, вплоть до гемина, в присутствии молекулярного кислорода, являются потенциальными центрами радикалообразо-вания и ингибиторами Тад-полимеразы. Поэтому при выделении ДНК из крови необходимо большое внимание уделять степени очистки проб от геминовых дериватов. [c.83]

П. Очистка ДНК-полимеразы I из лизата клеток Е. oli 594 (см. список штаммов) [c.138]

Хотелось бы подчеркнуть, что научная работа Л.И. Патрушева не ограничивается теоретическими изысканиями и литературной деятельностью. Эту сторону научной работы ему удается плодотворно совмещать с экспериментальными исследованиями генетических явлений. Вместе со своими сотрудниками автор монографии внес заметный вклад в биотехнологию, получив одним из первых в России высокопродуктивный бактериальный штамм-продуцент термостабильной ДНК-полимеразы Ткегтиз адиа1киз и разработав эффективные методы ее очистки. В настоящее время этот фермент находит широкое применение во многих лабораториях у нас в стране и за рубежом. Являясь членом Международного общества по исследованию тромбозов и гемостаза (18ТН), Л.И. Патрушев разработал универсальную систему ал-лель-специфической ПЦР, которая, в частности, позволяет диагностировать мутации, ассоциированные с тромбофилиями, и с ее помощью впервые осуществил анализ генетической структуры российской популяции в отношении распространенности данных генетических маркеров. В этом направлении на стыке генетики и медицины он продолжает активно работать и в настоящее время. То, что Л.И. Патрушев знает о генетических методах не понаслышке, придает его книге особую ценность, так как читатель может найти в ней много советов и рекомендаций (см., например, раздел о полимеразной цепной реакции в первой части книги), которые могут оказать практическую помощь при проведении его собственных исследований. [c.7]

Смотреть страницы где упоминается термин РНК-полимеразы очистка: [c.139] [c.308] [c.367] [c.422] [c.422] [c.423] [c.426] [c.431] [c.434] [c.436] [c.145] [c.28] [c.425] [c.65] [c.65] [c.117] [c.20] [c.10] [c.162] [c.389] [c.35] [c.260] [c.76] [c.78] [c.122] [c.158]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология