Протопласты трансформация

Таким образом, при использовании различных методов воздействия (индуцированный мутагенез, слияние и регенерация протопластов, трансформация хромосомных генов и др.) на микроорганизмы имеется возможность получить штаммы с высоким уровнем биосинтеза антибиотических веществ. [c.153]

Трансформация растительных протопластов. Осуществляется благодаря комбинации методик кальциевой преципитации ДНК и слияния протопластов. Для трансформации может быть использован практически любой ДНК-вектор. Донорная ДНК может не содержать специальных биологических сигналов (vir-областей, пограничных областей Т-ДНК). [c.148]

В табл. 17.1 перечислен ряд методов трансформации однодольных растений. Некоторые из этих методов требуют удаления клеточной стенки с образованием протопластов. Последние поддерживают в культуре как независимо растущие клетки или в специальной питательной среде, где они образуют клеточные стенки из таких клеток может быть регенерировано целое растение. Кроме того, разработаны методы трансформации, позволяющие вводить клони- [c.379]

Открываются пути привнесения дополнительной генетической информации по желанию экспериментатора в целях создания трансгенных растений. Прямой перенос чужеродной ДНК в протопласты возможен также с помощью микроинъекции, трансформации, упаковки в липосомы с последующим их эндоцитозом растительными протопластами, и электропорации (высоковольтных электрических импульсов). [c.518]

Сходным образом трансформируют протопласты, однако такого рода трансформация значительно менее эффективна из-за низкой способности к регенерации самих протопластов. [c.60]

Микроинъекции ДНК. В ряде экспериментов было показано, что метод микроинъекций может успешно применяться для трансформации растительных клеток аналогично микроинъекциям в животные клетки. Это стало возможным после преодоления ряда технических трудностей, в частности, разработки метода получения протопластов для инъекций путем прикрепления их к стеклам полилизином. [c.61]

Трансформация растительных протопластов происходит с эффективностью не более 10—15 %, независимо от типа вектора, и подходит как для двудольных, так и для однодольных растений. [c.61]

При создании высокопродуктивных штаммов микроорганизмов используют ряд других приемов, например конъюгацию плазмидами, слияние протопластов (даже межвидовых), трансформацию хромосомных генов и др. [c.151]

Одним из условий дальнейших успехов на пути получения клеток и клеточных систем с новыми свойствами является углубление знаний, касающихся фундаментальных основ биологии механизмов регуляции процесса клеточной дифференциации, физиологии протопластов как объекта биологической трансформации клеток, взаимоотношений клеточных органелл. Следовательно, прогресс в развитии клеточной инженерии и использовании получаемых с ее помощью новых, создаваемых искусственным путем биологических объектов будет в значительной степени определяться успехами в области клеточной биологии и клеточной физиологии. [c.122]

Таким образом, используя естественную компетентность или индуцируя компетентное состояние клеток, можно осуществлять генетическую трансформацию различных видов микроорганизмов, имеющих промышленное значение. Когда же трансформировать клетки не удается, с этой целью получают их протопласты. [c.123]

В последние годы в генетико-селекционной работе все чаще используются микробные протопласты. С помощью слияния протопластов можно получать генетические рекомбинанты у тех видов и щтаммов микроорганизмов, у которых не обнаружены собственные системы обмена наследственной информацией и которые в естественных условиях никогда не скрещиваются между собой. Трансформация протопластов, по-видимому, является универсальным способом введения молекул ДКК в клетки бактерий, актиномицетов, дрожжей и грибов. [c.124]

Применение методов молекулярного клонирования к актино-мицетам оказалось возможным благодаря разработке эффективных способов получения и регенерации протопластов, трансформации протопластов плазмидной ДНК и трансфекции фаговой ДНК, конструированию векторных молекул на основе плазмид и фагов. [c.166]

В разд. 3.2 мы остановимся на том, как определить оптимальные условия для введения векторной ДНК в протопласты в присутствии ПЭГ, оценивая количество используемой ДНК. Поглощение ДНК контролируется с помощью гибридизации, чтобы подтвердить включение векторной ДНК в протопласты. В разд. 3.3 изложены методики электропорации протопластов и оценки эффективности процесса трансформации путем измерения временной экспрессии DMGT-вектора в клетках, полученных из обработанных протопластов. Трансформация протопластов путем микроинъекций описана в разд. 3.4. [c.203]

Для трансформации дрожжей обычно используют три способа. В первом случае экзогенную ДНК добавляют к клеткам дрожжей, клеточные стенки которых удалены химически или энзиматически (протопласты) (1). В других случаях клетки перед добавлением чужеродной ДНК обрабатывают ацетатом лития (2) или подвергают электропорации (3). Трансфекцию культур животных клеток осуществляют инкубацией клеток с ДНК, осажденной фосфатом кальция или ДЕАЕ-декстраном (1), либо электропорацией в присутствии очищенной трансфицирующей ДНК (2). Как уже упоминалось в гл. [c.136]

Рис. 18.11. Плазмидный вектор, содержащий кластер генов хитиназы риса и кластер генов устойчивости к гигромицину, использовавщийся для трансформации протопластов риса. Трансформацию осуществляли обработкой протопластов полиэтиленгликолем в присутствии плазмидного вектора. Затем отбирали клетки, устойчивые к гигромицину, и проводили тестирование клеток на наличие генов хитиназы с помощью гибридизации по Саузер-ну и на наличие самой хитиназы методом Вестерн-блоттинга. Далее из клеток регенерировали целые растения.

В последние годы достигнуты большие успехи, связанные с генетической трансформацией клеток, в том числе и растительного происхождения. Схема трансформации включает в себя получение протопласта, введение в него необходимой генетической информации, формирование полноценной растительной клетки, клонирование и регенерацию. (Подробно техника генно-и1гженерных экспериментов будет описана в следующем разделе.) В данной схеме трансформированный протопласт — суспензионная культура — каллусная культура — целое растение (рис. 31.4) — наиболее тех- [c.498]

При введении в протопласты нового генетического материала в виде чистой ДНК последняя не всегда сохраняется и экспрессируется в хозяйских клетках. Весьма перспективным представляется использование в качестве векторов Ti-плазмид Agroba terium tumefa iens (раздел 9.5.3), так как они непосредственно включаются в ДНК хозяина и легко экспрессируются при образовании опухолей. Ti-плазмиды, содержащие или не содержащие чужеродной ДНК, могут вызвать трансформацию протопластов растений. По-видимому, такие исследования будут проводиться все более интенсивно. [c.390]

В отличие от механизмов переноса ДНК, описанных ранее, а именно конъюгации, трансдукции и трансформации, при которых ДНК передается от донора реципиенту, перенос генетической информации при слиянии протопластов не носит однонаправленного характера. [c.471]

Чаргафф и его сотрудники [58] выделили ДНК из протопластов дикого штамма Е. oli и этой ДНК обрабатывали мутант, ну кдаю-щийся в лизине. Оказалось, что в результате такой обработки у бактерий, ауксотрофных по лизину, восстанавливается про-тотропный тип питания, при котором протопласт уже не нуждается в поступлении лизина извне. Эта форма бактериальной трансформации была названа ими восстановительной . [c.304]

Будущее Ba illus thuringiensis. Усилия ученых п новшества в технологии применения улучшили современные продукты Bt. однако самых значительных достижений мы ждем от биохимиков и генетиков. Методы работы с ДНК и плазмидами были использованы для доказательства того, что гены, контролирующие синтез кристаллов, локализованы на небольшом числе плазмид значительной молекулярной массы [626, 627]. Обзор доказательств этого, сделанный Дином [625, 628], включает результаты исследований ученых по трансдуцирующим фагам и трансформации протопластов. [c.311]

Липосомы — это сферические образования, оболочки которых состоят из фосфолипидов. Их можно получить в результате резкого встряхивания или обработки ультразвуком водных эмульсий фосфолипидов. С помощью липосом в протопласты растений были введены РНК вируса табачной мозаики, ДНК Ti-плазмиды А. tumefa iens, а также целые метафаз-ные хромосомы. К преимуществам систем переноса с помощью липосом можно отнести их низкую токсичность по отношению к клеткам и возможность использования на множестве растений, клетки которых способны утилизировать липосомы. В настоящее время этот способ трансформации применяется все реже из-за его технической сложности и низкой трансформирующей активности (0,5—1 %). [c.62]

Г аплоиды, полученные in vitro, могут применяться не только в практической селекции, но и в работах по генетической инженерии, а также по клеточной селекции. Пыльцевые зерна являются в некоторых случаях более удобными, чем протопласты, объектами для опытов по генетической трансформации. [c.136]

Недостаток метода состоит в том, что не всегда удается воспроизвести результаты в генерациях продуцента. Облучение клеток донора и реципиента дает в этом случае увеличение частоты рекомбинаций. Трансформация протопластов хромосомальной ДНК возможна лишь в том случае, если протопласты заключены в липосомы при этом методе также возрастает частота рекомбинантов. [c.153]

Все рассмотренные выше методы селекции продуцентов биологически активных веществ сегодня, в период интенсивного развития методов генной инженерии, называют традиционными методами. Эти методы в прошедшие 30 лет в огромной мере содействовали созданию микробиологической промышленности антибиотиков, аминокислот, ферментов, витаминов и других практически важных веществ. Исчерпали ли традиционные методы свои возможности Нам кажется, думать так преждевременно, как и надеяться на то, что генная инженерия в ближайшее время сможет быть применена для создания и улучшения обширного круга принадлежащих к разным таксономическим группам продуцентов, которыми располагает сейчас микробиологическая промышленность. Даже более реальная возможность использовать иа основе генноинженерных методов в качестве продуцентов микроорганизмы, для которых эти методы наиболее отработаны, например E sheri hia oli, едва ли удовлетворит промышленность числом продуктов микробного синтеза. В связи с этим очень важно для старых перспективных в промышленном отношении микроорганизмов, помимо совершенствования методов отбора нужного типа мутантов, развивать методы генетического обмена на основе слияния протопластов, трансдукции, трансформации хромосомной и плазмидной ДНК, которые расширяют возможности традиционных методов селекции. Вместе с тем у промышленных микроорганизмов все шире проводится поиск плазмид и предпринимаются попытки их использования в качестве векторов при переносе генетического материала, его клонировании и амплификации. Эти исследования важны для понимания генетического контроля сложных процессов синтеза, таких, иапример, как синтез антибиотиков, для выявления узких мест в биосинтезе многих других продуктов. Одновременно они приближают промышленные микроорганизмы к объектам генной инженерии. Методология генной инженерии постоянно совершенствуется и расширяет свои возможности. В таком успешном встречном развитии разных методов и их слиянии на все большем числе продуцентов можно представить себе ближайшее будущее селекции микроорганизмов, призванной обеспечить промышленность высокопродуктивными штаммами. [c.95]

Активность трансформирующей и трансфеиирующей ДНК уменьшается при любых воздействиях, разрывающих ее молекулы, в том числе в процессе очистки. Поэтому представляет определенный интерес способ трансформации, при котором к суспензии компетентных клеток добавляется заранее приготовленная взвесь протопластов, хранившихся в гипертоническом растворе (см. 7. гл. 2.). Протопласты тут же лопаются, и высвобождаемая из них ДНК с большой молекулярной массой обеспечивает высокий выход трансформантов (G. Bettinger, F. Young, 1975). [c.116]

Компетентные клетки отличаются от некомпетентных изменением свойств клеточной оболочки. У них снижен поверхностный заряд, повышена чувствительность к осмотическому шоку. Последнее обстоятельство, обусловлено, по-видимому, тем, что у компетентных клеток обнажены участки цитоплазматической мембраны. Предполагается, что именно с ними и взаимодействует трансформирующая ДНК. Прямое доказательство роли частичного удаления клеточной стенки для трансформации клеток Вас. subtilis было получено Прозоровым (А. А. Прозоров, 1965). Он показал, что лизоцим в концентрации 1 — 2 мкг/мл заметно повышает выход трансформатов. При этом еще не происходит превращение клетки в протопласт. Более того, значительное удаление клеточной стенки подавляет компетентность. [c.119]

Термин протопласты применяют для обозначения структур, которые образуются после полного удаления клеточной стенки у клеток растений и микроорганизмов (С. Weibull, 1958). Когда нет уверенности в том, что клеточная стенка целиком отсутствует, или когда электронно-микроскопические исследования прямо указывают на сохранение каких-то ее элементов, говорят о сфе-ропластах и соответственно о слиянии и трансформации сферо-пластов. Таким образом, сферопласты — это частичные протопласты. Следует отметить, что в некоторых случаях эффективность процессов слияния и трансформации при неполном удалении клеточной стенки заметно снижается. [c.124]

Варьируя соответствующие параметры, можно, по-видимому, подобрать условия для получения и реверсии протопластов самых разных видов микроорганизмов. Однако, как считает Л. Аль-фёльди, эта работа до сих пор остается больше искусством, чем наукой (Ь. АИоШ , 1981). Следует подчеркнуть, что только определив условия, обеспечивающие удовлетворительную реверсию протопластов (обычно, не ниже 0,1%) к клеточной форме, можно приступать к их слиянию и трансформации. [c.126]

ПЭГ оказался универсальным агентом, вызывающим слияние протопластов различных видов эукариотических и прокариотических микроорганизмов, а также обеспечивающим их трансформацию и трансфекцию. Чаще всего с этой целью применяют полимер со средней молекулярной массой от 1000 до 6000 Д в концентрации 30—50% (масса/объем). При этих концентрациях осмотические стабилизаторы можно не использовать, поскольку эту функцию выполняет сам ПЭГ. Ионы Са + повышают частоту слияния протопластов, и при pH 7,5 оптимальная их концентрация составляет 10 мМ. Ионы Мп " обычно ингибируют слияние. Кроме того, этот процесс подавляется высокими концентрациями ионов Na+, К" . С1 , NO3 и небольшими примесями ЕДТА, который иногда добавляют при протопластировании клеток. Слияние протопластов идет уже при 4°С, и эффективность его увеличивается при повышении температуры до 30°С. В этих условиях для успешного завершения процесса достаточно [c.127]

Для трансформации и трансфекции протопласты и ДНК смешивают и обрабатывают ПЭГ. На эффективность проникновения ДНК в клетки влияет ряд факторов температура выращивания и возраст мицелия, концентрации литических ферментов, ионов Са , и сахарозы и т. д. Оптимальные условия различны для разных штаммов Streptomy es. Максимально полу- [c.166]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология