Антитела, использование в различных методах

Для многих исследований, связанных с изучением биологических структур (низкомолекулярные биорегуляторы, гормоны, макромолекулы, дифференцировочные маркеры клеток и др.), большую ценность представляют реагенты, способные специфически взаимодействовать с данной структурой. Универсальным реагентом, обладающим указанным свойством, считается молекула иммуноглобулина. Несмотря на то что иммуноглобулины, являясь антителами, взаимодействуют только с антигеном, т. е. с молекулой, способной вызвать иммунный ответ, для большинства структур удается подобрать условия, при которых они становятся антигенами и индуцируют выработку комплементарных антител (например, при конъюгации с сильными иммуногенами). Именно этим объясняется большое распространение иммунологических методов, связанных с использованием антител, в различных областях биологии и медицины. [c.89]

Иммуноферментный анализ, возникший более пятнадцати лет назад на пересечении иммунохимии и инженерной энзимо-логии, стал в настоящее время одним из распространенных методов исследования. Явные преимущества нового метода, к которым относится простота выполнения, доступность и стабильность реагентов, экспрессность и возможность автоматизации для проведения массовых анализов, обеспечили его прочное положение в клинической биохимии, при диагностике заболеваний растений и животных, в научных исследованиях. Благодаря успехам биотехнологии иммуноферментный анализ далее интенсивно развивался, поскольку с помощью генной инженерии были получены в высокоочищенном виде малодоступные антигены, а также ферменты-маркеры и их конъюгаты с антигенами, а с помощью клеточной инженерии — моноклональные антитела с заданной специфичностью и аффинностью. Новые направления развития иммуноферментного анализа связаны с использованием различных методов регуляции ферментативной активности при детектировании комплексов антиген — антитело. Именно этим вопросам и посвящена предлагаемая книга. [c.5]

В гл. 2. Технология конъюгации антител с ферментами (например, пероксидазой хрена, ПХ) описана в кн. 2. Существуют коммерческие препараты конъюгированных с ПХ антител к иммуноглобулинам различных видов животных (см. приложение). На рис. 6.17 приведены результаты Вестерн-блоттинга, полученные при использовании иммуноферментного метода. [c.233]

Принцип использования флуоресцирующих антител был приспособлен и для электронной микроскопии антитела или гаптены соединяются с электроноплотными веществами (например, с железосодержащим белком ферритином) или такими, которые могут быть сделаны электроноплотными уже после реакции антиген — антитело (например, с антителом связывается пероксидаза из хрена, которой после связывания дают возможность реагировать с диаминобензидином). На практике используется множество комбинаций, включающих антисыворотки с различными специфичностями, фрагменты антител, гаптены, а также такие маркеры для визуализации, как небольшие вирусы и т. п. Эти методы, применимые к целым бактериям, позволяют локализовать поверхностные антигены точнее, чем это делают с помощью оптического микроскопа. Преимущества электронной микроскопии становятся еще более очевидными, когда меченые антитела применяют еще до фиксации, заливки и приготовления срезов, так что метка видна в тонких срезах. В некоторых случаях аналогичным образом метят не антитела, а другие вещества с известной специфичностью чаще всего применяются лектины растений, такие, как конканавалин А, которые специфично связываются с сахарными остатками [88]. [c.125]

Тематический спектр данной монографии очень широк. Это и технология получения и применения рекомбинантных ДНК, и описание высокоразрешающих и чувствительных методик обнаружения и фракционирования белков, и различные примеры использования моноклональных антител, и характеристика методов фракционирования клеток (включая фракционирование на клеточном сортере), и описание манипуляций с некоторыми особо интересными для иммунологов видами животных и их зародышами. [c.5]

Сейчас проводится много экспериментов с использованием реагентов, образующих поперечные связи между белковыми молекулами. В частности, используются бифункциональные соединения, способные ковалентно связываться с двумя различными —SH- или —ЫНг-груп-пами [93—95]. Использование этого подхода дало возможность идентифицировать следующие связанные поперечными связями пары [93, 95] S2-S3, S4-S6, S4-S8, S4-S9, S4-S12, S5-S8, S5-S9, S7-S8, S7-S9, S11-S18, S13-S19 и S18-S21. Другой подход состоит в том, чтобы получать специфические антитела к отдельным рибосомным белкам и изучать при помощи электронного микроскопа места их связывания на поверхности рибосомных субчастиц [96, 97]. Этим методом была установлена локализация многих белков на поверхности как 30S-, так и 505-субчастиц (рис. 15-13). В ряде случаев антитела к определенному белку связывались сразу в нескольких участках. Тот факт, что связывающие места для антител к белкам S2, S12, S15 и S18 отстоят друг от друга на 8—19 нм, свидетельствует о том, что эти белки в 305-субчастице находятся в вытянутой, фибриллярной [c.230]

В заключение укажем также на возможность использования реакции Брдички для изучения различных тонких взаимодействий белковых молекул (например, взаимодействий антиген — антитело и др. [336]), для определения малого содержания протеинов, металлов и решения других научных и практических задач биологии и смежных наук. В этом плане представляет интерес высказывание Б. А. Кузнецова о том, что применение полярографического метода в биологической науке позволит получить много ценных данных возможности здесь почти неисчерпаемы [И, с. 304]. [c.242]

На каждом этапе колоночной хроматографии содержание белка в смеси увеличивается не более, чем в 20 раз. и поэтому выделить из сложной смеси белков отдельный белок за один цикл практически невозможно. На долю каждого белка, как правило, приходится менее 1/1000 всего белка клетки, и для его очистки требуется последовательное использование нескольких различных типов колонок (рис. 4-47). Гораздо более эффективен метод аффинной хроматографии (хроматография но сродству). В основе этого метода лежат биологически важные взаимодействия, происходящие на поверхности белковых молекул. Так, при ковалентном связывании субстрата фермента с матриксом, например, с полисахаридными шариками, фермент специфически удерживается матриксом и может быть элюирован (смыт) практически в чистом виде. Подобным образом можно иммобилизировать короткие олигонуклеотиды ДНК определенной структуры (см. разд. 4.6.8) и использовать подобные носители для очистки ДНК-связывающих белков, опознающих данную последовательность нуклеотидов на хромосомах (см. разд. 9.1.8). С матриксом можно связать и специфические антитела такой носитель очень удобен для очистки белков, узнаваемых этими антителами. Аффинные колонки обладают высокой степенью специфичности за один цикл хроматографии можно добиться очень высокой степени очистки (1000-10000 раз). [c.213]

Среди -различных требований, предъявляемых к современному биохимическому анализу, самым важным является специфичность, т. е. способность детектировать данное вещество в сложных многокомпонентных средах, таких, как сыворотка крови, сок растений или ферментационная среда. Наибольшей специфичностью обладают иммунохимические методы, основанные на реакции антител с антигеном, образующие друг с другом прочные комплексы. Возможность получения высокоспецифичных антител к широкому кругу различных веществ в сочетании с чувствительными методами регистрации образовавшихся комплексов обусловливают широкое практическое использование методов иммунохимического анализа в различных областях медицины, ветеринарии, растениеводства, охраны окружающей среды, контроля биотехнологических процессов, научных исследованиях. [c.99]

Вторичный иммунологический ответ получен во многих экспериментах in vitro при использовании различных методов эксплантации в культурах суспензии лимфоидных клеток, при культивировании фрагментов лимфоидной ткани в плазменном сгустке во вращающихся пробирках и при эксплантации в органные культуры. В качестве индукторов антителообразования испробовались бактериальные и дру гие белковые антигены. Для обнаружения синтезированных in vitro антител использовались различные по своей чувствительности иммунологические и химические методы. В некоторых из таких исследований проводился и морфологический анализ культур. [c.114]

Высокоспецифичным для диагностики ВИЧ-инфекции является метод иммунноблотинга (см. подразд. 1.4.5). При этом проводится электрофоретическое разделение вирусных белков с последующим перенесением их на мембрану из нитроцеллюлозы. Затем мембрана обрабатывается исследуемой сывороткой. Заключительный этап исследования состоит в выявлении антител к различным белкам ВИЧ. Для этого в систему добавляют антивидовые меченые сыворотки. Индикацию образующихся иммунных комплексов проводят с использованием ИФА или РИА. Результаты иммуноблотинга считают положительными при обнаружении антител к определенным вирусным антигенам р24, рЪ1, а также к gpЛ или к gp]20. [c.308]

Существует много различных методов анализа специфических осадков в количественной иммунохимии. Выбор конкретной методики в значительной стенени диктуется содержанием антитела в применяемых сыворотках и экономией в использовании ценных реагентов, таких, как антигены, сыворотки и олигосахариды, доступность которых может быть ограниченной. Детальное описание имеющихся методов, которые можно применять для анализа любого желаемого количества азота антитела, от одного до нескольких сотен микрограммов, дано Кабатом [5]. Количественный метод осаждения, онисанный нигже в качестве примера, был применен для анализа систем декстран — антидекстран [8—11], но он может иметь и более широкое применение. [c.437]

Особое распространение получили методы, основанные на использовании антигенов и антител, меченных ферментами, — так называемый иммунофермеитный анализ. Они используются для изучения широкого круга соединений — антител, пептидных и стероидных гормонов, вирусных и бактериальных антигенов, различных белков и ферментов. Существуют гетерогенные (твердофазные) и гомогенные методы иммуноферментного анализа, принципиально различающиеся способом разделения компонентов иммунохимической реакции. Твердофазные методы основаны на применении антител или антигенов, иммобилизованных на нерастворимых носителях. [c.306]

Мембранные домены могут поддерживаться клеткой и без межклеточных контактов. К примеру, сперматозоид животных - это отдельная клетка, состоящая из двух структурно и функционально различных частей - головки и хвоста, покрытых непрерывной плазматической мембраной. Нри исследовании клеток спермы методом иммунофлуоресцентной микроскопии с использованием различных антител к антигенам поверхности клетки обнаружили, что плазматическая мембрана состоит по крайней мере из трех различных доменов (рис. 6-37). В некоторых случаях антигены могут диффундировать внутри собственных обособленных доменов. Однако остается непонятным механизм того, каким образом поддерживается обособлеппость этих доменов. [c.376]

На сегодняшний день разработано более тридцати вариантов различных методов ИФА, различающихся по характеру используемых реагентов и последовательности отдельных стадий. Такое множество вариантов анализа обусловлено в основном различными способами модуляции ферментативной активности в гомог цных методах и использованием различных комбинаций меченных ферментами и иммобилизованных на носителе реагентов (антигенов и антител) в гетерогенном ИФА. [c.83]

Обзор современных подходов. Для измерения абсолютных количеств антител было предложено по меньшей мере четыре различных метода, С применением каждого из этих методов связаны определенные теоретические и (или) практические проблемы. Метод сравнения со стандартом основан на исполь зовании стандартной сыворотки (содержание антител в ней установлено по независимым критериям), с которой сопоставляют содержание соответствующих антител в исследуемых образцах, Этот метод дает достоверные результаты, только если значения аффинности антител в сыворотке и в стандарте находятся в диапазоне, для которого связывание не зависит ог аффинности (см, выше). Величина ошибки, которая привносится из-за такого допущения, была выявлена в цитировавшихся ранее специальных исследованиях (Butler et al,, 1978). При использовании мультивалентных антигенов важно, чтобы антитела образца и стандарта обладали одинаковой специфичностью. Так называемый прямой метод ELISA основанный на исполь- [c.237]

После появления подробной публикации по разработанному нами методу (Tsang et al., 1983а) и тем более с момента первого сообщения по его применению (Tsang et al., 1982) мы несколько модифицировали саму методику, что позволило повысить разрешение и сделать ее в целом менее трудоемкой. Методика, представленная в данной публикации, в настоящее время непосредственно используется в нашей и в ряде других лабораторий. Полученные с ее помощью результаты оказались весьма полезны для выявления сложных взаимодействий антиген—антитело при различных инфекциях. Данный метод был также эффективно использован для изучения ряда вопросов, связанных со специфичностью продуцируемых моноклональных антител. [c.342]

Гомогенность и специфичность центров связывания моноклональных антител делают их особенно удобными для использования в иммуноаффинной хроматографии. В табл. 6.15 мы приводим высокоэффективный метод получения иммуносорбентов для колонок и их применения, а также различные варианты условий элюции, которые позволили нам очень эффективно с сохранением их биохимической активности очистить макромолекулы, обладающие высокой чувствительностью к воздействию оазличпых агентов и находящиеся в низкой концентрации. [c.196]

В медицине моноклональные антитела применяют прежде всего для диагностики различных заболеваний. Такие бактериальные заболевания, как кокковые, паразитарные инфекции, малярия, а также грибки хламидии, при помощи мкАТ диагносцируются гораздо точнее, чем другими, традиционными методами. В вирусологии использование мкАТ дало возможность разработать условия антигенного анализа вирусов гораздо более информативного, чем при использовании поликлональных антител. Этот метод позволил получить уникальную информацию об антигенных детерминантах ДНК- и РНК-содержащих вирусов и их изменчивости. В частности, были идентифицированы антигенные детерминанты вирусов гриппа, полиомиелита, гепатита А и др. [c.495]

Весьма эффективным методом уточнения топографии мембранных белков, прежде всего точной локализации внемембранных участков, является использование моноклональных антител. Для получения гибридом использовались фрагменты бактериородопсина, полученные путем его расщепления протеолитическими ферментами. Наиболее ценными в этом случае оказались синтетические фрагменты коррелируя величину синтетического пептида и эффективность связывания соответствующего антитела, можно с высокой степенью достоверности зондировать выступающие из мембраны полипептидные петли. Ниже показана локализация различных антигенных детерминант молекулы бaктepиopoдoпtинa в пурпурной мембране (Г. Корана, И. Г. Абдулаев). [c.609]

Поскольку н Т-, н В-лимфоциты встречаются во всех периферических лимфоидных тканях, нужно было найти удобные методы, которые позволяли бы различать н разделять эти два типа клеток,-только после этого можно было изучать их индивидуальные свойства. К счастью, различительными маркерами могут служить многочисленные белки плазматической мембраны, характерные только для Т- нли только для В-клеток. Один нз наиболее часто используемых шркеров-гликопротеин Thy-], который у мышей имеется на Т-, но не на В-лимфоцитах поэтому антитела к Thy-1 можно использовать для удаления нли очистки Т-клеток из смешанной популящ1н лимфоцитов мыши. Использование антигенных маркеров клеточной поверхности для различения и разделения Т- и В-клеток революционизировало клеточную иммунологию и сыграло важную роль в быстром прогрессе этой области знания в последние годы. У экспериментальных животных и у человека находят все больше и больше новых маркеров, характерных для функционально различных субпопуляций Т- и В-лимфоцитов. [c.11]

В процессе эволюции иммунной системы выработался целый ряд различных механизмов, приводящих к большому разнообразию антиген-связывающих участков антител. Только часть из этих механизмов связана с описанными выше соматическими перестройками ДНК в ходе развития В-лимфоцитов. Эксперименты по подсчету числа генов с использованием метода гибридизации ДНК (см. разд. 4.5.5) показывают, что в геноме мыши, видимо, содержится несколько сотен Ук-сегментов, сходное число Ун-сегментов и только два Ух-сегмента. Из этого можно вычислить, что путем комбинирования различных унаследованных У-, D- н J-сегмеитов у мыши может образоваться по меньшей мере 10000 разных Ун-областен и 1000 разных yL-областей. [c.40]

Примером современного метода использования моноклональных антител для гистопатологической диагностики заболеваний человека может быть анализ биоптатов (образцов ткани) лимфатических узлов как способ определения типа опухолей лимфатической системы (например, болезни Ходжкина, различных лимфом и др.). [c.331]

В лаборатории Паулинга на основании исследования влияния сотен различных гаптенов и стереохимически сходных с ними веществ на реакции преципитации противосывороток, приготовленных против большого числа азопроизводных белков, была развита теория дополнительности в реакции антиген — антитело. Помимо использования для серологических исследований, соли диазония широко применялись для введения соединений, представляющих интерес с точки зрения физиологии или фармакологии. Несмотря на общеизвестность реакции сочетания белков с соединениями диазония, мы мало что можем сказать о физических свойствах измененных таким образом белков, хотя часто для этой цели можно было бы применять спектроскопические методы. Во многих случаях в реакцию сочетания с азосолью вступает вся сыворотка целиком, а не один только чистый белок. [c.328]

В опытах по иммунодиффузии раствор исследуемого препарата отделен от антисыворотки зоной геля, в который и препарат, и антисыворотка могут диффундировать (двойная диффузия). По другому способу раствор антигена диффундирует в гель, в котором уже находятся антитела (одиночная диффузия). С течением времени концентрация реагентов становится достаточно высокой для специфической преципитации, и в том месте, где это произошло, линия или полоса преципитации становится видимой. В общем случае каждая система антиген — антитело образует отдельную полосу. Для решения специфических вопросов преципитации разработано большое число различных экспериментальных приспособлений двойную диффузию обычно проводят в чашках Петри или (в меньших масштабах) в тонкой пленке геля на предметном стекле. Полосы можно сделать более заметными путем окрашивания. Одиночную диффузию удобнее проводить в маленьких вертикальных трубочках. Недавно Охтерлони [68] опубликовал обзор с исчерпывающей библиографией, охватывающей все аспекты иммунодиффузионного анализа. Очищенный препарат следует проверить в опытах по одномерной или двумерной диффузии при возможно большем числе концентраций препарата [69]. Появление одиночной полосы с обеими антисыворотками является доказательством гомогенности препарата. Однако гомогенный препарат не обязательно должен давать одиночную полосу. Имеется несколько причин, которые могут вызвать образование двойной полосы и в случае гомогенного антигена. Это может объясняться недостаточным контролем температуры или осаждением, напоминающим кольца Лизеганга, при использовании определенных типов антител, если применяется очень сильная неразбавленная антисыворотка. Более того, установлено, что гомогенный антиген, имеющий несколько антигенных детерминантов, может дать несколько полос преципитации. Эти вопросы обсуждены Кроуле [70] и Фингером [71]. Тем не менее гетерогенность является наиболее обычной причиной двойных или множественных полос нрецииитации. Следует иметь в виду, что неантигенные компоненты нельзя определить этим методом, и нужно также отметить, что примеси, дающие перекрестную реакцию, не будут найдены, если их скорость диффузии меньше, чем у гомологичного антигена [72]. Это обычно не вызывает осложнений, за исключением случаев, когда компонент, дающий перекрестную реакцию, сам является довольно сильным антигеном и может порождать свое собственное антитело, [c.53]

Важное усоверщенствование этого метода подразумевает использование антител. Антитела, специфически связывающиеся с клетками одного типа (из тех, что присутствуют в гкани), можно прищить к различным матриксам, например коллагену, полисахаридным щарикам или пластмассе. С такой поверхностью будут связываться лищь клетки, опознаваемые антителами. Связавшиеся клетки отделяют либо с помощью легкого встряхивания, либо путем разрушения матрикса (например, коллагена) ферментами (например, коллагеназой). [c.202]

Заметно не отличаются методы и в отношении размеров облучаемого кристалла и диаметра фокусного пятна. Так, при определении трехмерной структуры антитела Fab 17/9 (16) с использованием излучения рентгеновской трубки Elliott Gxl8 с вращающимся анодом образец имел размеры 0,30 0,04 0,02 мм , а фокусное пятно составляло всего 0,1 мм. Эти параметры явно не уступают условиям эксперимента с синхротронной радиацией. Можно однако полагать, что ситуация с кристаллизацией белков в последнем случае потенциально несколько предпочтительнее, так как мощное синхротронное излучение и его острый фокус позволяют использовать кристаллы, имеющие меньшие размеры и содержащие большие элементарные ячейки. Примеров, иллюстрирующих такую возможность, пока нет. На сегодняшний день проблема кристаллизации белков в обоих случаях стоит столь же остро, как и десятки лет назад. О трудностях получения качественных монокристаллов требуемой величины говорится почти во всех работах. Типично в этом отношении замечание авторов, исследовавших трехмерную структуру фермента из 839 аминокислотных остатков, липокси-геназу I "Кристаллы белка удалось получить после опробования более тысячи различных условий кристаллизации" [516. С. 1482]. Особенно сложное положение, как уже отмечалось, с кристаллизацией мембранных белков (о предпринимаемых здесь усилиях и относительных успехах см. [517-520]). [c.141]

Смотреть страницы где упоминается термин Антитела, использование в различных методах: [c.90] [c.119] [c.51] [c.2] [c.43] [c.127] [c.174] [c.370] [c.378] [c.415] [c.54] [c.140] [c.115] [c.524] [c.989] [c.657] [c.258] [c.190] [c.524]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология