Конъюгат p галактозидазой

Получение конъюгата [ -галактозидаза — биотин] [c.277]

Рис. 15-2. Кинетика связывания дигоксина (0,2 нмоль) с конъюгатом [Fab — -галактозидаза] ( 10 нмоль).

Для получения антисыворотки против Т4 и конъюгата [Т4— -галактозидаза] применяли методы, описанные в начале [c.260]

Б реакции конъюгации ХМТ с -галактозидазой (без последующей аффинной очистки конъюгата) была обнаружена зависимость величины остаточной активности фермента в супернатанте от молярного соотношения этих реагентов. При ожидаемых для конъюгата молярных соотношениях ХМТ и -галакто зидазы 8 1 и 12 1 ферментативная активность в супернатанте составила соответственно 30% и 50% исходной, в то время как понижение молярного соотношения до 4 1 и менее снижало, остаточную активность до 10% исходной. Наблюдаемое ослабление связывания конъюгата [ХМТ—В-галактозидаза] с ГА-ага- [c.260]

Приготовление конъюгатов ЩГС-МБ— -галактозидаза и [К-МБ— -галактозидаза ]. Присоединение КГС-МБ или К-МБ к i-галактозидазе в 0,05 М фосфатном буфере, pH 7,0 (буфер А), и очистку конъюгата [фермент-гаптен] на колонке с сефадексом G-25 проводили аналогично процессу получения и очистки конъюгата [Т4— -галактозидаза]. [c.267]

Модификация конъюгата [биотин — р-галактозидаза] [c.277]

Разработанные методы получения иммуноферментных конъюгатов с р-галактозидазой, содержащей до 20 5Н-групп, основаны на том, что связывание через них антигенов не отражается на каталитических свойствах фермента. Восстановленный меркапто-этанолом 1дО или его РаЬ-фрагменты связываются с р-галакто-зидазой с помощью N—Ы -о-фенилендималеимида, специфически реагирующего с 5Н-группами белков. Выход конъюгата по ферменту достигает 50% при высоком сохранении компонентами специфических свойств. Сульфгидрильную группу можно ввести в мягких условиях в соединения, содержащие аминогруппы, поэтому данная методика может быть распространена на целый ряд антигенов. [c.110]

Стабильность иммуноферментных конъюгатов при хранении— важнейший параметр, обусловливающий возможность их практического использования. Методы направленной стабилизации конъюгатов пока еще не разработаны. Не существует также корреляции между стабильностью конъюгатов и методом их получения. Однако вь1сокая стабильность гибридных молекул обеспечивает их применение на практике и значительно превосходит стабильность антител и антигенов, меченных радиоактивными изотопами. В лиофилизованном состоянии ферментные конъюгаты сохраняют свои свойства до двух лет. Стабильность при хранении в растворе (+4°С) более года отмечена для конъюгатов с щелочной фосфатазой, р-галактозидазой, лизоцимом, пероксидазой. [c.113]

Щелочная фосфатаза и ее конъюгаты имеют высокую стабильность и низкий предел обнаружения, однако недостатком является относительно высокая стоимость фермента. В последнее время разработаны сверхчувствительные ферментативные системы, позволяющие детектировать в растворе до нескольких тысяч молекул щелочной фосфатазы, основанные на использовании в качестве субстрата молекулы NADP. Образующийся в результате ферментативного гидролиза продукт NAD определяется в ферментативной системе регенерации кофактора. Такого рода подходы для определения щелочной фосфатазы являются весьма перспективными в плане создания на их основе сверхчувствительных методов ИФА. -D-Галактозидаза является также широко используемым ферментом как в гомогенном, так и в гетерогенном ИФА, [c.64]

Принцип стерического исключения субстрата был использован также для разработки метода определения макромолекулярных антигенов, таких, как альбумин, иммуноглобулины G и М. В анализе используют конъюгат антигена с р-/)-галактозидазой Е. соИ. После образования комплекса с антителами активный центр фермента становится недоступным для взаимодействия с искусственно синтезированным макромолекулярным субстратом о-Нитрофенил-Р-/)-гатактозидом, ковалентно связанным с водорастворимым полимерным декстраном. В присутствии антигена степень ингибирования фермента уменьшается пропорционально концентрации исследуемого соединения. Метод позволяет измерять IgG в микро-граммовых количествах в течение нескольких минут. [c.116]

Известно несколько примеров получения конъюгатов IgG с пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой, глюкозооксидазой и р-/)-галактозидазой с применением в качестве гомобифункциональ-ного сшивающего реагента п-бензохинона. Метод основан на реакции п-бензохинона с амино- и тиогруппами белка, скорость которой зависит от pH. Благодаря этому был разработан двухстадийный способ получения конъюгатов, когда п-бензохиноновое производное белка получают при pH б, выделяют, а затем смешивают с другим белком при pH 8. Одна из возможных схем реакции следующая [c.185]

Синтез конъюгата Fab-фрагмента с -D-галактозидазой с помощью N, К-о-фенилендималеимида. [c.186]

Синтез конъюгата кроличьих антител против IgG-овцы с p-D-галактозидазой с помощью SIAB. [c.188]

Синтез конъюгата бластицидина-S с -D-галактозидазой. [c.196]

Рис. 8-4. Турбидиметрический анализ многовалентных антигенов, основанный на активировании фермента. Многовалентный антиген из образца последовательно реагирует с антителами, меченными -галактозидазой, и модифицированными антителами, несущими большой отрицательный заряд (вследствие обработки янтарным ангидридом). В образующемся комплексе фермент окружен отрицательными зарядами. При анализе с помощью поликатиояного макромолекулярного субстрата (см. рис. 8-1) ферментный конъюгат, входящий в состав комплекса, проявляет большую активность по сравнению со свободным конъюгатом или конъюгатом, связанным только с антигеном, Аг — антиген, Ат — антитело, Ф — фермент

Так же как в колориметрическом иммуноанализе на основе ингибирования, антиген метили ферментом. К каждой молекуле ферритина присоединялись три молекулы -галактозидазы. Активность конъюгата по расщеплению высокомолекулярного флуорогенного субстрата подавлялась при инкубации с анти-ферритином — антителами козы против ферритина (рис. 8-9). При насыщающих концентрациях антител ингибирование достигало 50%. Добавление вместе с субстратом избытка антител против IgG козы сильно увеличивало ингибирование ненасыщающими концентрациями антиферритина (рис. 8-9). Однако [c.110]

ВХОДИТ несколько молекул моновалентных антител, неизбежно ограничивает чувствительность определения до значений, характерных для конкурентных методов. Это обусловлено невозможностью отделения полностью свободных антител от би- или поливалентных антител, у которых хотя бы один из центров связывания остался свободным —и те, и другие будут связываться с сорбентом. В то же время в ряде случаев требования к чувствительности определения антигена таковы, что их вполне удается удовлетворить с использованием немономерных конъюгатов [фермент — моновалентные антитела], особенно при наличии антител с высоким сродством к антигену. В качестве примера можно отметить разработку на основе ИААК чувствительного (нижний предел обнаружения 0,2 нМ) и очень точного (коэффициент вариации меньше 3%) автоматизированного метода определения дигоксина (Leflar et al., 1984). В этом случае для детектирования использовали немономерный конъюгат типа [F(ab )s — р-галактозидаза]. [c.247]

Хотя, строго говоря, метод ИААК должен быть отнесен к классу гетерогенных ИФА, этап разделения связанных и свободных реагентов в этом методе осуществляется настолько просто и быстро (особенно при использовании соответствующего оборудования), что позволяет сопоставить его с современными вариантами гомогенного анализа. Время инкубации после добавления к образцу препарата моновалентных антител, конъюгированных с ферментом, определяется главным образом концентрациями антител и антигена, поскольку их взаимодействие в данном случае представляет собой простую обратимую бимолекулярную реакцию, зависящую только от диффузии. В табл. 15-1 представлены результаты расчета скорости взаимодействия антиген — антитело в зависимости от их относительного содержания в реакционной смеси. Единственным допущением при расчетах является величина константы скорости прямой реакции ЫО л моль -с выбранная на основании данных, полученных для большинства исследованных систем взаимодействия небольших антигенов с антителами (Pe ht, 19 2). Из расчетных данных табл. 15-1 следует, что даже для определения тестируемого компонента, концентрация которого не превышает пикомолярного уровня, использование большого избытка конъюгата [фермент—антитело] (на наномолярном уровне) позволяет ожидать быстрого количественного связывания и завершения анализа не более чем за 5—10 мин. Кривая, построенная на основании изучения кинетики связывания дигоксина с мономерным конъюгатом [Fab — -галактозидаза] (рис. 15-2), подтверждает справедливость расчетных оценок. Концентрации дигоксина и конъюгата в этих экспериментах составляли 0,2 нМ и 10 нМ соответственно. Как видно на ри- [c.249]

Данные, представленные на рис. 15-3, отражают влияние скорости потока на эффективность анализа. Они были получены для определения дигоксина с использованием мономерного конъюгата [Fab — -галактозидаза] и колонок (0,5x2 см) с аффинным сорбентом [сефадекс G-10 — сывороточный альбумин человека — уабаин] (об использовании уабаина вместо дигок- [c.251]

Схема анализа приведена на рис. 16-1. В стеклянную пробирку 16x10 мм вносят 150 мкл фосфатного буфера, а затем добавляют 5 мкл стандартного раствора, содержащего О, 2, 4, 5 или 10 мг/л ХМТ и 5% БСА, Последовательно добавляют по 100 мкл конъюгата [ХМТ — -галактозидаза] в соответствующем [c.259]

НОГО конъюгата [ХМТ— -галактозидаза] с антителами к ХМТ приводит к полному предотвращению образования комплексов между ХМТ— -галактозидазой и ГА-агарозой. Столь полного ингибирования связывания конъюгата [ХМТ— -галактозидаза] с ГА-агарозой не наблюдалось в случае конъюгатов с молярными соотношениями ХМТ и -галактозидазы 4 1 или менее (рис. 16-4). Эти результаты указывают на необходимость подбора оптимального молярного соотношения -галактозидазы и ХМТ в конъюгатах для проведения эффективного определения методом ИФАПЗ. Снижение уровня фона путем очистки конъюгата [ХМТ— -галактозидаза] на колонке с ГА-агарозой и высокая эффективность ингибирования связывания [ХМТ— -галактозидаза] с ГА-агарозой антителами к ХМТ [c.261]

Получение конъюгата [фермент — гаптен]. Присоединение ДСА-МБ к -галактозидазе осуществляют так же, как это описано для Т4 в разделе, посвященном ИФА Т4. К 1,5 мл 0,5 М фосфатного буфера, pH 7,0, содержащего 0,5 мг -галактозидазы (0,93 нмоль), добавляют раствор ДСА-МБ ТГФ (0,2 мг/мл, 10 нмоль). Смесь инкубируют 2 ч при комнатной температуре. После диализа в течение ночи против того же фосфатного буфера смесь очищают хроматографией на колонке (1,5x40 см) с сефадексом G-25. Для анализа дигоксина используют фракции с максимальной ферментативной активностью. [c.269]

В случае ИФА кортизола для конъюгации гаптена с сульфгидрильными группами -галактозидазы были синтезированы производные кортизола — КГС-МБ и К-МБ. С целью сравнения нашего метода конъюгации с разработанными ранее мы проводили также связывание КГС с аминогруппами -ra-лактозидазы методом смешанных ангидридов. Сравнение полученных конъюгатов проводили методом осаждения вторыми антителами при избытке антител против кортизола. Установлено, что при использовании метода смешанных ангидридов метится только 40% молекул фермента, при этом ферментативная активность снижается на 20%. При использовании разработанного нами метода конъюгации с производными гаптена без заметного снижения ферментативной активности метится более 95% фермента (табл. 17-1). Число молей КГС-МБ или К-МБ, связанных с ферментом, непосредственно не определяли. Однако, как и в случае конъюгата [Т4 — фермент], можно счн тать, что с каждой. молекулой -галактозидазы связывается до 12 молекул гаптена. Изучали также иммунологическую активность и специфичность взаимодействия конъюгатов [гаптен — фермент] с антисывороткой против кортизола. Конъюгаты типа [КГС— ,-гaлaктoзидaзa] и [КГС-МБ— -гаЛактозидаза] обладают высокой иммунологической активностью, но лишь в незначительной степени вытесняются из комплекса с антителами [c.271]

Рис. 18-3, Связывание конъюгата [ДНФ-пизин — -галактозидаза — биотин] с ави-дин-сефарозой. К 200 мкл раствора конъюгата (1,36 нмоль) добавляли различные количества 10%-ной суспензии сорбента. Доводили объем смеси до 600 мкл 0,5%-ным раствором желатины в 0,1 М фосфатном буфере, pH 7,2, инкубировали 30 мин при 25 С и центрифугировали 5 мин на микроцентрифуге Эппендорф . В надосадочной жидкости (500 мкл) определяли активность -галактозидазы по расщеплению хромогенного субстрата о-нитрофенил- -ra-лактопиранозида (светлые кружки). Осадки трижды промывали, суспендируя их в 1 мл 0,5%-ного раствора желатины, 0,1 М фосфатного буфера, pH 7,2, с последующим 5-минутным центрифугированием. Определяли ферментативную активность, суспендируя осадки в 3 мл раствора субстрата (темные кружки), Все ферментативные реакции проводили при 25 °С в течение 30 мин.

Смотреть страницы где упоминается термин Конъюгат p галактозидазой: [c.112] [c.278] [c.149] [c.186] [c.194] [c.14] [c.82] [c.85] [c.93] [c.105] [c.108] [c.109] [c.168] [c.174] [c.247] [c.248] [c.248] [c.253] [c.254] [c.258] [c.259] [c.260] [c.262] [c.264] [c.267] [c.278]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология