Гомогенный иммуноферментный анализ

Рис. 22. Принципиальные схемы гомогенных методов иммуноферментного анализа а—Г — свободный гаптен Е—Г — меченный ферментом гаптен АЬ — антитела 5 н Р — субстрат н продукт ферментативной реакции б — Ag—5 — меченный субстратом антиген Ag — свободный антиген Е — фермент Р — продукт ферментативной реакции символ х — ингибирование ферментативной реакции

Несомненно, будущее метода связано с выполнением гомогенного иммуноферментного анализа на новых автоматических анализаторах. Спрос клинических лабораторий на современную автоматику, вероятно, возрастет, так как курс на уменьшение расходов заставляет сокращать численность персонала. С этим же связан и переход от массового тестирования к анализу отдельных образцов, выбранных из большого набора. Приборы, пригодные для осуществления принципа произвольных выборок , уже теперь доступны для клинических лабораторий. [c.54]

Рис. 11-2. Схема реакций, протекающих при гомогенном флуоресцентном иммуноферментном анализе с применением антител, меченных ферментом.

Иммуноферментный анализ без разделения компонентов (гомогенный анализ) и с их разделением [c.12]

Рассмотрен гомогенный иммуноферментный анализ гаптенов без разделения компонентов, причем особое внимание уделено [c.54]

Титр антисыворотки сильно зависит от концентрации антигена, используемого дл я тестирования и от способа его определения. Например, одна и та же сыворотка может иметь титр 100 в тесте иммунопреципитации и 100 000 в тесте иммуноферментного анализа. Поэтому при тестировании сыворотки и определении титра лучше всего применять тот же метод, что и при анализе, а концентрацию антигена выбирать близкую к минимальной в том диапазоне, который выбран для анализа. Кроме того, следует учитывать, что в иммуноферментном анализе используют как гомогенные, так и гетерогенные методы определения концентрации антигена, которые могут сильно отличаться по структуре образующихся иммунных комплексов. В частности, в твердофазных методах вероятность образования циклических комплексов антиген — антитело значительно меньше, чем в гомогенных, а следовательно, и Наблюдаемая аффинность антител в обеих системах будет разная. [c.158]

Кровь, лишенная клеточных элементов, называется плазмой. В плазме содержится фибриноген, приводящий к образованию во всем объеме пробирки сгустка фибрина, который осторожно удаляется центрифугированием при 1000—2000 об/мин в течение 15 мин. Плазма, лишенная фибрина, называется сывороткой. Для удаления белков системы комплемента сыворотку прогревают в течение, 30 мин при 56°С, при этом антитела сохраняют свою активность. Обработку крови и получение сыворотки надо проводить с максимальной осторожностью, избегая разрушения (гемолиза) эритроцитов. Наличие внутриклеточных белков и ферментов в сы-, воротке может приводить к появлению дополнительного фона в некоторых модификациях иммуноферментного анализа. Это замечание касается прежде всего использования антисывороток в гомогенных методах. [c.153]

Очевидно, что при разработке гомогенного иммуноферментного анализа для определения макромолекул следует учитывать размеры антигена. Нельзя ожидать, что связывание антител с антигеном, меченным при помощи фермента, скажется на ферментативной активности по отношению к малому субстрату, так как массивный антиген не передает воздействия ферменту. Однако в случае крупного субстрата присоединение антител, вероятно, приведет к ингибированию в результате стерического [c.103]

Антигены, меченные субстратами и кофакторами, также нашли применение в гомогенных методах иммуноферментного анализа. Сущность этих методов (уравнения 6, 7, 8) заключается в том, что при взаимодействии меченого антигена с антителами субстрат становится не доступным для действия фермента, в результате чего продукт ферментативной реакции не накапливается в системе (рис. 22, б) [c.115]

С точки зрения способа выполнения все методы иммуноферментного анализа (ИФА) можно разбить на две группы 1) системы, не требующие разделения компонентов (гомогенные методы), и 2) системы, для которых такое разделение необходимо (гетерогенные методы). В системах, не требующих разделения, ферментативную активность анализируемого раствора измеряют без предварительного физического разделения меченых лиган- [c.12]

Иммуноферментные наборы, основанные на принципе EMIT, в настоящее время являются наиболее эффективным средством для быстрого определения наркотиков и лекарственных соединений. Если ранее широкое применение гомогенного ИФА сдерживалось возможностью определения только низкомолекулярных антигенов, то разработанные в последние годы подходы позволяют проводить быстрый количественный анализ макромолекулярных белковых антигенов и антител. К ограничениям применения гомогенных методов следует отнести меньшую чувствительность, чем в гетерогенном ИФА (исключением являются системы с биолюминесцентной детекцией), и сложность анализа биологических сред, содержащих в значительной концентрации эффекторы или кофакторы фермента. [c.123]

Иммуноферментный анализ без разделения компонентов (гомогенный анализ) [c.13]

Особое распространение получили методы, основанные на использовании антигенов и антител, меченных ферментами, — так называемый иммунофермеитный анализ. Они используются для изучения широкого круга соединений — антител, пептидных и стероидных гормонов, вирусных и бактериальных антигенов, различных белков и ферментов. Существуют гетерогенные (твердофазные) и гомогенные методы иммуноферментного анализа, принципиально различающиеся способом разделения компонентов иммунохимической реакции. Твердофазные методы основаны на применении антител или антигенов, иммобилизованных на нерастворимых носителях. [c.306]

Показано, что модуляторы ферментов могут служить универсальными метками для иммуноферментного анализа без разделения компонентов (т. е. для гомогенного анализа). Предъявляемым требованиям лучше всего удовлетворяют модуляторы, легко образующие прочные конъюгаты с лигандами и обладающие высоким связывающим сродством к индикаторному ферменту. Для повышения чувствительности ИФА нужно использовать конъюгаты [модулятор — лиганд], проявляющие к индикаторному ферменту максимальное сродство. [c.66]

Следует обратить внимание читателей на те основные тенденции развития иммуноферментного анализа, которые прослеживаются в представленной книге сокращение времени анализа и упрощение методик благодаря переходу к гомогенным методам анализа применение двойных меток (два фермента, фермент и якорная группа и т. д.), которые повышают специфичность детектирования ферментной метки использование моноклональных антител и множественный антигенный анализ для повышения специфичности иммунохимической стадии детектирования. Принципиально новым является создание методов иммунохроматографии, в которых концентрация вещества определяется не по активности ферментного конъюгата, а по его хроматографической подвижности. [c.6]

Структура. В гомогенном иммуноферментном анализе обычно используют малатдегидрогеназу из сердца свиньи. Молекула фермента состоит из двух идентичных субъединиц с молекулярной массой по 35 000. Каждая из субъединиц имеет центр связывания молекулы кофермента NAD+ и обладает каталитической активностью при диссоциации молекулы на субъединицы. Изоэлектрическая точка 6,2. Молекула содержит 14 SH-rpynn, две из которых существенны для связывания субстрата в активном центре. Фермент достаточно стабилен и сохраняет активность в течение года при 4°С в виде суспензии под сульфатом аммония. [c.75]

Вполне успешно использовавшийся для определения гаптенов гомогенный иммуноферментный анализ значительно реже применяли для определения антител. Недавно описаны такие методики для определения антител к лекарственным препаратам [29]. Цель разработки заключалась в упрошении существующих методик определения антител при сохранении требуемой чувствительности. Метод основан на ингибировании ферментативной активности конъюгата антиген-фермент определяемыми антителами, а в качестве фермента применяли глюкозо-б-фосфатдегидрогеназу (СбРВ) [c.217]

Все описанные выше методики относятся к числу гетерогенных. Известны и гомогенные методы иммуноферментного анализа с амперометрическим определением. Так, концентрацию антнэпи-лептического препарата фенитоина можно измерять с помощью [c.215]

Фермент-зависимые метки (ФЗМ) — универсальные и чувствительные метки для иммуноанализа. Они отличаются продолжительным периодом полуинактивации, не создают радиационной опасности и позволяют проводить, иммуноферментный анализ (ИФА) без разделения компонентов (гомогенный анализ). ИФА без разделения требует меньше манипуляций и легче поддается автоматизации. Однако на нынешнем этапе своего развития этот метод недостаточно чувствителен. В то же время ИФА с разделением компонентов (гетерогенный анализ) обладает высокой чувствительностью и дает возможность определять два различных вещества одновременно. Превосходным примером высокой чувствительности ИФА с разделением компонентов служит метод определения ферритина, позволяющий измерять 0,2 аттомоль, т. е. 2-10 моль вещества (Ishikawa et al., 1982). [c.32]

Часть I. иммуноферментный АНАЛИЗ БЕЗ РАЗДЕЛЕНИЯ КОМПОНЕНТОВ (гомогенный аналиэ [c.36]

Иммуноферментный анализ с применением в качестве метки простетических групп (ИФАПГ) представляет собой метод иммуноанализа без разделения компонентов (т. е. гомогенного анализа). Метод основан на 1) способности прочного ковалентного конъюгата [лиганд—простетическая группа] активировать апофермент, который сам по себе не проявляет ферментативной активности 2) способности антител против лиганда соединяться с конъюгатом [лиганд—простетическая группа], лишая его возможности активировать апофермент. [c.69]

FAD С образованием каталитически активного ко 1плекса ДНФ—АпоГО FAD (реакция IIJ). Таким образом, количество продуктов, выделяющихся в реакции IV, пропорционально количеству определяемого вещества. Данные, приведенные на рис. 7-4—7-5, свидетельствуют о появлении нового метода иммуноферментного анализа без разделения компонентов (гомогенного метода). [c.102]

В Исследовательском институте Syva разработаны два типа гомогенных методов иммуноферментного анализа для высокомолекулярных веществ. Методы первого типа связаны с применением -галактозидазы и макромолекулярного субстрата (Gibbons et al., 1980). Методы второго типа основаны на использовании ферментных каналов (Litman et al., 1980) с участием двух или большего числа ферментов. В этой главе мы рассмотрим принципы, особенности, ход выполнения и клинические приложения методов обоих типов. [c.103]

К счастью, потенциометрические методы иммуноферментного анализа не обязательно являются гетерогенными по своей сути. Гомогенные методы удобнее, чем гетерогенные, так как включают меньшее число операций. Фононг и Рехнитц [6] описали метод гомогенного потенциометрического иммуноферментного анализа для человеческого иммуноглобулина О с использованием СО2-электрода. В этом методе получают конъюгат IgG, меченный ферментом, и затем ингибируют активность последнего, связывая конъюгат с антителами к IgG. Используемая ферментная метка, хлоропероксидаза, несколько необычна. Это гем-содержащий фермент, который катализирует ряд реакций галогенирования органических молекул в присутствии пероксида водорода и соответствующего галогенида, например бромирования (3-кетоадипиновой кислоты. Этот процесс сопровождается образованием СО2, что и используют в данном аналитическом методе [c.62]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология