ДНК-зонды радиоактивные метки

Нерадиоактивные методы детекции В большинстве лабораторий для гибридизации используют зонды, меченные каким-либо радиоактивным изотопом, чаще всего Р. Такие зонды обладают высокой удельной радиоактивностью и обеспечивают хорошее отношение сигнал/шум. Радиоактивно меченный зонд наносят на фильтр с фиксированной на нем ДНК-мишенью, проводят гибридизацию, отмывают несвязавшуюся ДНК-зонд и детектируют метку с помощью радиоавтографии. [c.190]

Момент мечения ДНК-зондов, очевидно, выбирают так, чтобы можно было использовать Р-нуклеотиды с наивысшей удельной активностью. Введение метки имеет много недостатков, в частности, ее радиоактивность может быть опасна для здоровья. Однако еще важнее, видимо, то, что время полураспада составляет всего 14 дней, поэтому зонды приходится метить заново каждые 1-2 недели. Использование нерадиоактивных меток в ДНК-зондах позволит преодолеть многие из этих недостатков и разработать диагностические наборы для определения нуклеотидной последовательности ДНК мутантных генов, вирусов, микроорганизмов и т.д. [c.75]

Далее используют генный зонд (разд. 25.1.6). Это короткий одноцепочечный фрагмент ДНК, последовательность оснований которого комплементарна участку интересующего нас гена. Зонд можно получить в больщих количествах путем клонирования. В него вводят радиоактивную метку з Р, а затем добавляют его в раствор для гибридизации (комплементарного связывания) с ДНК на нитроцеллюлозном или нейлоновом фильтре. [c.259]

Первым шагом является расщепление геномной ДНК рестрикционной эндонуклеазой. К настоящему времени обнаружено около 90 рестрикционных эндонуклеаз. Все они разрезают ДНК по определенным сайтам в нуклеотидной цепи ДНК, в результате чего получаются фрагменты воспроизводимого размера. Затем пробу расщепленной ДНК (обычно 5 или 10 мкг) помещают в лунку в 0,8%-ном агарозном геле и подвергают горизонтальному гель-электрофорезу. Отрицательно заряженные фрагменты ДНК мигрируют к аноду со скоростью, соответствующей их размеру,- самые маленькие фрагменты путешествуют дольше всего. Гель пропитывают раствором бромистого этидия, при этом фрагменты ДНК становятся видимыми и их можно сфотографировать в ультрафиолетовом свете. Затем, чтобы получить одноцепочечные фрагменты ДНК, гель пропитывают щелочью. После нейтрализации в сильном буферном растворе гель приводят в контакт с нитроцеллюлозным или найлоновым фильтром, чтобы перенести на последний фрагменты ДНК. При этом фильтр кладут на гель и покрывают сухой бумажной салфеткой, на которую переходят фрагменты ДНК из геля в том же порядке, в каком они мигрировали в геле. Фрагменты фиксируют на фильтре, высушивая его (если использовали нитроцеллюлозный фильтр), после чего фильтр (с пятнами Саузерна) готов к гибридизации с содержащим радиоактивную метку ДНК-зондом. [c.69]

Заморозить сухим льдом Отмыть этанолом Погрузить в жидкий агар Денатурировать ДНК Добавить радиоактивный зонд Отмыть несвязавшуюся метку Радиоавтография [c.357]

На следующем этапе работы эту пленку помещают в раствор, содержащий так называемый зонд, т.е. одноцепочечные молекулы нуклеиновой кислоты, комплементарные отыскиваемым в библиотеке и содержащие радиоактивную метку. Таким радиоактивным зондом может служить информационная РНК, выделенная из ткани, в которой наиболее активно функционирует интересующий нас ген это может быть также искусственный дезоксиолигонуклеотид, синтезированный так, чтобы отвечать известной последовательности аминокислот в том белке, который кодируется разыскиваемым нами геном наконец, это может быть рестрикт из другого участка клонируемой ДНК. Радиоактивный зонд гибридизирует с комплементарной ДНК на поверхности пленки. Затем с пленки смывают не вступившие в гибридизацию остатки зонда и производят радиавтографию, позволяющую установить, где именно на поверхности пленки, а значит и на поверхности чашки Петри, располагаются негативные колонии, содержащие ДНК, способную гибридизировать с зондом (рис. 9.15). Затем из соответствующих негативных колоний можно выделить фаг, содержащий интересующий нас фрагмент чужеродной ДНК. [c.282]

ДНК-полимераза I (или Pol I) Е. oli находит широкое применение в работе с рекомбинантными ДНК и при определении нуклеотидной последовательности ДНК. Одно из важнейших применений этого фермента связано с введением радиоактивной метки в ДНК in vitro с помошью так называемой ник-трансляции, направляемой ферментом за счет сопряженных полимеразной и 5 З -экзонуклеазной активностей. Этот процесс позволяет добиться необычайно высокого включения радиоактивной метки в ничтожные количества ДНК, т. е. получать препараты с гораздо более высокой удельной активностью (оцениваемой в импульсах в минуту на 1 мкг ДНК), чем при введении метки in vivo. Радиоактивные ДНК-зонды, полученные с помощью ник-транс- [c.113]

С. применяют в научных исследованиях, особенно широко в виде производных, меченных радиоактивными атомами или флуоресцентньпли метками (см. Липидные зонды), к-рые позволяют тестировать поведение С. в тканях, клетках или мембранных структурах. Гликосфинголипиды (особенно ганглиозиды) и антитела к ним используют в лечении нек-рых патологич. состояний. [c.488]

Экспериментальные данные о процессах перегруппировки генов, кодирующих константные и вариабельные участки иммуноглобулиновых цепей, были получены с помощью методов, основанных на применении рекомбинантных ДНК. Для этого из фракции полисом выделяли мРНК, кодирующую L-цепь миеломы, на ее основе с помощью обратной транскриптазы получали кДНК, которую клонировали на плазмид-ном векторе. Наработанную в значительных количествах клонированную кДНК расщепляли подходящей рестриктазой таким образом, чтобы получить два фрагмента, соответствующих V- и С-участкам L-цепи. Фрагменты ДНК разделяли препаративно с помощью электрофореза, вводили радиоактивную метку с помощью ник-трансляции, денатурировали и использовали в качестве зондов для идентификации фрагментов рестрикции ДНК из миеломных или эмбриональных клеток, содержащих последовательности, комплементарные последовательностям зондов. Наиболее существенно, что, как показано на рис. 16.22, в ДНК клеток миеломы оба V- и С-кодирующих участка локализуются на одном и том же со RI-фрагменте, в то время как в эмбриональной ДНК они находятся на различных Есо RI-фрагментах. Это означает, что на каком-то этапе развития между эмбриональной клеткой и дифференцированным лимфоцитом происходит специфическая перестройка ДНК, которая в данном случае привела к удалению Есо RI-сайта (или сайтов), находившегося в рамках протяженной области ДНК между V- и С-ко-дирующим участками в эмбриональной ДНК. После такой перестройки эти участки оказались расположенными в непосредственной близости друг к другу. Комбинация генов L-цепи, возникшая при их перегруппировке в ходе дифференциации лимфоцита, при его последующем митотическом делении устойчиво наследуется дочерними клетками. [c.241]

Рис. 10-4. Схема стандартного метода выявления радиоактивно меченных молекул РНК, имеющих определенную нуклеотидную последовательность. В том случае, если молекулы РНК могут образовать гибридный РНК/ДНК дуплекс с од-ноцепочечным фрагментом ДНК, используемым в качестве специфического зонда, эти молекулы остаются неповрежденными в процессе нуклеазной обработки и легко обнаруживаются по радиоактивной метке. В экспериментах, описанных в тексте, очищенные сегменты ДНК. соответствующие разным генам, были получены с помощью клонирования молекул кДНК, которые, в свою очередь, были синтезированы путем обратной транскрипции суммарной мРНК

Для каждого заданного времени реакции обычно ставят по две параллельных пробы. Фоновые значения радиоактивности ТХУ-нерастворимой фракции определяют до добавления фермента. Включение метки в РНК (в кислотонерастворимую фракцию) к концу реакции обычно составляет 30—90%. Обратите внимание на то, что при использовании этого метода анализа не требуется знать точного объема реакционной смеси, поскольку общая радиоактивность и радиоактивность включившейся в РНК метки измеряются на одном и том же фильтре. Однако для определения суммарного количества радиоактивной метки, включившейся в зонд, необходимо знать точный объем реакционной смеси. [c.25]

Методы прямого анализа ДНК всегда более предпочтительны, поскольку не связаны с изучением семей. Так, в диагностике талассемии большие надежды возлагают на применение специфических олигонуклео-тидных зондов и разработку методов гибридизации без использования радиоактивной метки. Однако при этом заранее необходимо предполагать, какой именно му- [c.99]

Плазмидйые зонды для выявления контаминации клеточных культур микоплазмами сконструированы уже несколькими исследовательскими группами [67—71]. Применение гибридизационного метода в описанной нами модификации ограничено теми лабораториями, где возможна работа с радиоактивными изотопами. Развитие этого метода и его более широкое распространение связывают с заменой радиоактивной метки на ферментную, т. е. с использованием щелочной фосфатазы или пероксидазы хрена, которые могут быть пришиты к плазмидным зондам с помощью биотин-авидиновых комплексов. [c.120]

Создание зонда для гсиа р-глобина связано с получением матричной РНК р-глобина из созревающих эритроцитов, где активно синтезируется гемоглобин. Затем с помощью фермента обратной транскриптазы, который обеспечивает считывание нуклеотидной последовательности м-РНК в комплементарную последовательность ДНК, получают так называемую к-ДНК с высокой радиоактивной меткой. В настоящее время созданы библиотеки к-ДНК из разных источников. Имеются геномные библиотеки человека, полученные генно-инженерными методами, а также хромосомно-специ-фические библиотеки, полученные из отдельных специфических хромосом или их участков. Создание таких библиотек требует выделения отдельных хромосо.м. В настоящее время это стало возможным благодаря сортировке хромосом цитофлуорометрическим методом. Для синтеза к-ДНК используются также автоматизированные устройства, в том случае, если производится синтез к-ДНК гена определенного белка, аминокислотная последовательность которого известна. [c.69]

Способ получения специфического ДНК-зонда зависит от той информации, которой мы располагаем в отношении клонируемого гена. Во многих случаях интересующий нас белок можно идентифицировать химическими методами и выделить хотя бы в малых количествах в очищенном виде. Нескольких микрограмм чистого белка достаточно для того, чтобы определить последовательность первых трех десятков аминокислот в его молекуле. Из этой аминокислотной последовательности на основе генетического кода можно вьвести соответствующую нуклеотидную последовательность. Получив эти данные, синтезируют химическим путем два набора олигонуклеотидов ДНК, каждый длиной приблизительно 20 нуклеотидов, и вводят в них радиоактивную метку. Два набора используют в расчете обеспечить соответствие двум разным участкам предсказанной нуклеотидной последовательности клонируемого гена (рис. 5-84). Колонии клеток, обнаружившие способность к гибридизации с обоими наборами ДНК-зондов, скорее всего содержат требуемый ген поэтому именно их сохраняют для дальнейшего исследования (см. ниже). [c.333]

Если ДНК человека разрезать с помощью рестриктаз на фрагменты длиной 4000 нуклеотидов, то получится около 1 млн фрагментов. Как в такой груде найти и извлечь из нее искомый фрагмент Это можно сделать, используя ДНК-зонды. Зонды представляют собой фрагменты одноцепочечной ДНК длиной около 20 нуклеотидов, содержащие радиоактивную (например, " Р) или другую метку. Нуклеотидная последовательность зонда должна быть комплементарна какой-то части искомого фрагмента ДНК. Зонд вносят в раствор фрагментов ДНК, смесь нагревают для денатурации ДНК, затем охлаждают для ренативации ДНК. При этом часть искомых фрагментов соединится с зондом, таким образом искомый ген окажется меченым (рис. 3.16). Затем смесь разделяют электрофорезом и по наличию радиоактивной метки находят нужный фрагмент. РНК тоже можно использовать в качестве зонда. [c.113]

Для определения концентрации веществ в большинстве иммунохимических методов к анализируемому раствору, содержащему определяемое соединение и его меченый аналог, добавляют реагент в количестве, намного меньшем необходимого по уравнению (7.12). Как немеченые, так и меченые соединения взаимодействуют с реагентом практически одана-ково, поэтому отношение их концентраций будет одним и тем же в растворе и в связанном состоянии. При этом возможность применения метода во многом определяется доступностью меченого антигена и соответствующих антител. Для введения метки используют различные реагенты радионуклиды, ферменты, красящие вещества, флуоресцентные и хеми-люминесцентные зонды, ионы металлов. До последнего времени в качестве маркеров антител применяли радиоактивные изотопы этот метод назьшается радиоиммунохимическим анализом (РИА). При этом степень [c.298]

С., меченные радиоактивными атомами или флуоресцентной меткой (см. Липидные зонды), используют при проведении медицинских и биохим. исследований. В клетках С. гидролизуются при действии фермента сфингомиелиназы до церамида R H(0H) H(NH 0R ) H20H и фосфохолина. При наследственных дефектах в биосинтезе этого фермента [c.488]

Липкие концы ДНК. Комплементарные одноцепочечные участки ДНК, выступающие на противоположных концах двухцепочечной молекулы. Ник-трансляция. Метод введения метки в ДНК основан на том, что ДНК-полимераза Es heri hia oli способна осуществлять деградацию одной из цепей ДНК, в которой до этого был сделан разрез ( ник ), и тут же строить новую цепь, используя неповрежденную в качестве матрицы. Если в реакционную смесь ввести меченые нуклеозидтрифосфаты, то вновь образуемая цепь окажется радиоактивной, что дает возможность ее использования в качестве зонда. [c.51]

При инкубации фильтра с раствором, содержащим меченый зонд, происходит гибридизация комплементарных цепей ДНК-зонда и фрагмента на фильтре. Неспецифически связанные молекулы зонда отмываются с помощью специальной процедуры. Радиоактивно меченные участки выявляют путём экспонирования фильтра с рентгеновской плёнкой (ауторадиография). После проявления на плёнке видны полосы меченной зондом ДНК. Нерадиоактивные метки визуализируют с помощью флюоресценции или опосредованно с помощью антител. [c.264]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология