ДНК-лигаза соединяет фрагменты

Рис. 28-10. Прерывистая репликация одной из цепей ДНК в виде коротких фрагментов. Цепь, которая реплицируется непрерывно (в направлении движения репликативной вилки), называется ведущей. Другая цепь реплицируется с перерывами, в виде коротких фрагментов (фрагменты Оказаки) направление ее репликации противоположно направлению движения репликативной вилки. Фрагменты Оказаки соединяются затем друг с другом с помощью ДНК-лигазы, образуя отстающую цепь. У прокариот фрагменты Оказаки достигают длины 1000-2000 нуклеотидов. В животных клетках они содержат 150-200 нуклеотидов.

В действительности процесс репликации ДНК более сложен, чем описанный выше. Считается, что примерно двадцать белков участвуют в процессе репликации, в том числе и такие, которые разделяют родительские цепи, присоединяют и удаляют небольшие фрагменты затравок, вырезают неправильно присоединившиеся основания и исправляют поврежденные участки. Кроме того, оказывается, что синтез новой цепи на матрице происходит не как одна непрерывная стадия, но путем синтеза небольших цепей (фрагментов Оказаки), которые затем соединяются друг с другом с помощью фермента ДНК-лигазы. Затравкой этих фрагментов могут служить короткие цепи РНК, позднее заме- [c.150]

ДНК-лигазе, использованной Кораной в синтезе гена, для соединения элементов донора и акцептора требовалось применение матрицы из Е. соИ, инфицированной бактериофагом Т4. Однако была выделена менее требовательная РНК-лигаза. Она катализирует фосфорилирование З -гидроксильной группы рибоолигонук- еотида 5 -фосфатом донора. Фермент, по-видимому, не проявляет специфичности к основаниям и такие малые фрагменты как тримеры могут быть соединены им без участия матрицы. Сшиванием двух гексамеров r(Ap)s и rp(Up)5U был получен с прекрасным выходом додекамер r(Ap)s p (Up)5U [17]. [c.187]

ДНК-лигаза ковалентно соединяет фрагменты [c.35]

В 1968 г. Оказаки сообщил, что в процессе репликации в бактериальных клетках появляются короткие фрагменты ДНК, получившие название репликационных фрагментов (или фрагментов Оказаки) [27]. В дальнейшем было сделано еще одно важное открытие—был обнаружен новый фермент ДНК-лигаза [28, 29], способный объединять два фрагмента ДНК в непрерывную цепь. Специфическое действие этого фер.мента заключается в репарации ( залечивании ) одноцепочечных разрывов ДНК- Разорванная цепь молекулы ДНК содержит, как это видно из уравнения (15-4), свободные З -гидроксильную и 5 -фосфатную группы, которые должны быть соединены. ДНК-лигаза Е.соИ активи- [c.198]

Синтез и клонирование рекомбинантных ДНК. Ген или его фрагмент, имеющий липкий конец, может по принципу комплементарности взаимодействовать с липким концом другого, не родственного ему фрагмента ДНК, полученным при действии на ДНК одной и той же рестриктазы (рис. 3.23). Фрагменты ковалентно соединяют друг с другом с помощью ДНК-лигазы и получают рекомбинантные (или гибридные) ДНК. [c.90]

ДНК-лигаза соединяет фрагменты ДНК [c.26]

Химический синтез палиндромных двухцепочечных олигонуклеотидов, получивших наименование линкеры (связывающие звенья) дает возможность клонировать любые фрагменты чужеродной ДНК безотносительно к специфичности сайтов рестрикции. Эти короткие тупоконечные (т.е. не обладающие одноцепочечными концами) молекулы двухцепочечной ДНК могут ДНК-лигазой фага Т4 ковалентно соединяться с произвольными тупоконечными фрагментами ДНК, которые мы хотим клонировать (рис. 9,13), Эти фрагменты могут выстригать- [c.279]

Длинные фрагменты РНК полу чают из коротких, соединяя их с помощью РНК-лигазы. [c.301]

Фрагменты хромосомной ДНК бактерии-донор а и ДНК вектора соединяют ковалентно ДНК-лигазой. [c.104]

Фрагменты Оказаки соединяются друг с другом при помощи ДНК-лигазы [c.905]

Фрагменты ДНК, имеющие одинаковые липкие концы, могут соединяться друг с другом с помощью ДНК-лигазы, при этом сайт рестрикции восстанавливается. Фрагменты, имеющие тупые концы, могут быть соединены вне зависимости от того, какой рестриктазой они были образованы. Фрагменты с липкими концами более удобны для создания рекомбинантных ДНК, так как ДНК-лигаза обеспечивает беспрепятственное соединение фрагментов. [c.27]

Соединение фрагментов по тупым концам. Тупые концы фрагментов ДНК, полученные после действия рестриктаз, производящих прямой разрез внутри сайта рестрикции, также могут быть соединены за счет действия ДНК-лигазы. В этом случае реакция лигирования имеет свои особенности и ее эффективность на порядок ниже, чем при сшивке по липким концам. Однако преимущество соединения фрагментов с тупыми концами по сравнению с липкими 6 том, что не имеет значения, какие рестриктазы образовывали эти тупые концы фрагменты, образованные в результате действия разноименных рестриктаз, легко соединимы (рис. 1.5). [c.34]

Таким образом, из фрагмента ДНК с липкими концами получается фрагмент с тупыми , и он соединяется с другим фрагментом ДНК с тупыми концами ДНК-лигазой. [c.35]

Первый вопрос (когда ) касался фазы клеточного цикла, в которой возможен процесс интеграции [1]. К его постановке привели два открытия в 1967 г. Ричардсон обнаружил, что в клетке небольшие фрагменты ДНК могут соединяться с помощью фермента, получившего название ДНК-лигазы [32] в 1968 г. японский ученый Оказаки установил, что ядерная ДНК в фазе 8 клеточного цикла не реплицируется сразу в виде длинных цепей — новая ДНК строится отдельными фрагментами [33]. Сопоставление этих данных позволило заключить, что в фазе 8 фрагменты Оказаки соединяются при участии ДНК-лигазы [33]. В связи с этим возник вопрос быть может, ДНК онковируса, проникнув в нормальную клетку не в [c.69]

Каждый фрагмент Оказаки содержит праймер, который удаляет ДНК-полимераза Р (бета), постепенно отрезая от 5 -конца фрагмента по одному рибонуклеотиду. К З -концу фрагмента ДНК-полимераза Р присоединяет дезоксирибонуклеотиды в количестве, равном вырезанному праймеру, заполняя образованную брешь. ДНК-лигаза соединяет фрагменты запаздываюшей цепи ДНК. [c.64]

Фермент ДНК-полимераза I удаляет РНК-затравку и достраивает фрагменты, а ДНК-лигаза соединяет между собой соседние фрагменты Оказаки фосфодиэфирной связью, которая образуется между З -гидроксилом одного и -фосфатом другого фрагментов. Терминация синтеза ДНК определяется специфической последовательностью. Детали этого процесса пока неизвестны. Наконец, две дочерние хромосомы, образовавшиеся после репликации, прикрепляются к мембране. Рост участка мембраны между точками прикрепления раздвигает их, и разделение клеток заверщает процесс. [c.410]

Ковалентное присоединение происходит в том случае, когда два смежных участка одного олигонуклеотида (3) комплементарны крайним фрагментам других олигонуклеотидов (I и 2), которые благодаря комплементарным взаимодействиям укладываются на первом как на матрице. При этом концы их фиксируются так, что их положение максимально благоприятно для образования ковалентной фосфодиэфирной связи. После того как лигаза соединит эти два конца, образуется двзгоггевая ДНК-подобная структура, состоящая из олигонуклеотидов 3 и 4. Соединения 3 и 4 выделяют и используют для даль- [c.59]

Представление о том, что носителем генетич. информации является ДНК, возникло еще в 1944. Было известно также, что ген представляет собой отрезок ДНК, кодирующий определенный белок, и что передача наследств. ин(]юр-мации между поколениями происходит посредством удвоения молекул ДНК. Но любым манипуляциям препятствовала огромная молекулярная масса ДНК, составляющая миллионы и миллиарды иа клетку, и невозможность получать химически однородные небольшие ее фрагменты. Положение изменилось, когда удалось обнаружить и выделить два рода ферментов 1) рестриктирующие эндонуклеазы (рестриктазы)-они рассекают молекулы ДНК в пределах строго определенных нуклеотидных последовательностей их описано ок. 400, наиб, употребительны рестриктазы E o RI, Hind III, Bam HI, Pst I, Sal I и др. 2) ДНК-лигазы (прежде всего фермент кишечной палочки, индуцируемый бактериофагом Т4), к-рые сшивают двухцепочечные фрагменты ДНК, восстанавливая межнуклеотндные связи в местак единичных разрывов. С помощью этих ферментов получают удобные для генетич. операций фрагменты ДНК и соединяют их в единое целое. Для такого объединения безразлично происхождение ДНК (химически у всех существ она одинакова), между тем в природе объединению генетич. информации неродственных существ препятствуют разл. межвидовые барьеры. [c.518]

ДНК- и РНК-лигазы. Существуют ферменты, способные соединять между собой фосфодиэфирной связью целые фрагменты ДНК или РНК. Такие ферменты называются лигазами. Из многочисленного семейства лигаз наибольшее применение получили ДНК- и РНК-лигазы, синтезирующиеся в клетках, инфицированных бактериофагом Т4. Так, Т4 ДНК-лигаза квтализирует образование фосфодиэфирной связи между З -ОН- и б -РО -группами а одноцепочечных разрывах двухцепочечиых ДНК (схема а) или между такими же группами двухцепочечных молекул ДНК, содер жащих на концах комплементарные одноцепочечные последовательности (схема б). [c.352]

Оказалось, что дело обстоит иначе. В месте репликации двойная спираль ДНК слегка расплетается и обе цепи реплицируются небольшими фрагментами по 500—1000 мономерных единиц в длину (Оказаки, Су-гимото). Эти блоки образуются действительно путем встречного движения ферментов вдоль цепей. Но затем образовавшиеся блоки соединяются встык ковалентными (фосфоэфирными) связями. В итоге происходит как бы направленное продвижение точки репликации вдоль хромосомы. Стыкование блоков осуществляется с помощью специального фермента — полинуклеотид-лигазы. Этот фермент получен в чистом виде и хорошо изучен (Гурвиц, Вейс, Ричардсон). [c.197]

После завершения синтеза фрагмента Оказаки РНК-затравка (праймер) удаляется (нуклеотид за нуклеотидом) с помощью 5 - 3 -экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы I. По мере отщепления рибонуклеотидных мономеров каждый из них замещается на соответствующий дезоксирибонуклеотид в ходе полимеразной реакции, осуществляемой ДНК-полимеразой I (при этом в качестве затравки используется З -конед предыдущего фрагмента Оказаки). Новый фрагмент Оказаки присоединяется к отстающей цепи ДНК с помощью фермента ДНК-лигазы. Источником энергии для этой реакции у эукариот служит АТФ. ДНК-лигаза не может соединить две молекулы одноцепочечной ДНК. Цепи ДНК, соединяемые ДНК-лигазой, должны быть частью двухцепочечной молекулы ДНК. [c.304]

Если для вьщеления донорной ДНК (например, методом дробовика ) использовали рестриктазу, той же самой рестриктазой должна быть обработана плазмидная ДНК. Рестрикционные фрагменты донорной ДНК, среди которых есть и фрагмент с нужным геном, смешивают затем с плазмидной ДНК. При смешивании они соединяются липкими концами. Например, липкий конец —ААТТ будет соединяться с комплементарным липким концом —ТТАА. Вначале соединение происходит за счет водородных связей, но после добавления фермента, называемого ДНК-лигазой, образуются фосфодиэфирные связи. [c.222]

ТОВ, которые ТОЛЬКО позднее соединяются в ковалентно связанные непрерывные цепи в результате действия ДНК-лигазы. Как показано на фиг. 105, такое предположение может разрешить дилемму одновременного роста обеих антипараллельных полинуклеотидных цепей. Если репликация ДНК представляет собой микроскопически прерывистый процесс, как предполагал Оказаки, тогда синтез обеих антипараллельных цепей А и В можно рассматривать как процесс, протекающий в результате одной химической реакции, катализируемой ДНК-полимеразой, а именно как процесс связывания З -ОН-группы самого последнего нуклеотида, который уже включился в образующуюся цепь, с 5 -а-фосфатом следующего нуклеозидтрифосфата, который должен присоединиться к цепи. Таким образом, все короткие фрагменты образующейся А-цепи будут расти в том же направлении, в каком происходит движение репликацион-ной Y-вилки, а все короткие фрагменты образующейся В-цепи будут расти в противоположном направлении. [c.213]

Плазмиду рестрицируют Ваш HI и образовавшиеся линейные молекулы смешивают с фрагментами чужеродной ДНК, полученными также под действием этой рестриктазы. Одноцепочечные комплементарные концы этих молекул могут соединиться различными способами, прежде чем под действием лигазы возникнут ковалентные связи. Во-первых, концы линейной молекулы ДНК плазмиды могут соединиться друг с другом при этом восстановится исходная кольцевая плазмида с интактным геном tet. Возможно, однако (именно это и требуется), что перед превращением линейной молекулы ДНК плазмиды в кольцевую, между ее концами встроится фрагмент чужеродной ДНК при этом целостность гена tet нарушится. Полученной in vitro смесью молекул ДНК трансформируют клетки Е. соИ, предварительно обработанные ио- [c.278]

Наиболее простой и широко применяемый метод соединения фрагментов ДНК — это отжиг фрагментов, полученных после обработки ДНК рестриктазой, образующей липкие комплементарные однонитевые, концы, с последующей обработкой ДНК-лигазой. Лигаза катализирует образование фосфодиэфирной связи между соседними нуклеотидами, т. е. восстанавливает ковалентную непрерывность цепей ДНК (см. рис. 19). Наличие липких концов не является обязательным условием для воссоединения фрагментов ДНК-лигазой. Так, ДНК-лигаза, кодируемая фагом Т4 (но не лигаза Е. oli), способна соединять и полностью двунитевые фрагменты. Однако, для того чтобы эта реакция протекала эффективно, необходимо наличие высокой концентрации ДНК и значительно большей (приблизительно в 10 раз) концентрации фермента. [c.141]

Р. Оказаки, используя очень кратковременное (несколько секунд) мечение реплицирующейся ДНК с помощью Н-тимидина, показал, что значительная часть вновь синтезированной ДНК выделяется в виде коротких меченых фрагментов 1000— 2000 нуклеотидов. Эти фрагменты, получившие название фрагментов Оказаки, соответствуют коротким участкам репликации второй комплементарной цепи. На ней ДНК также синтезируется в направлении 5 —3. Каждый фрагмент Оказаки инициируется коротким полирибонуклеотидом (около 10 звеньев), который и служит затравкой для дальнейшего роста полидезоксирибонуклео-тида (рис. 6.11). После удаления РНК и заполнения бреши с помощью ДНК-полимеразы I фрагменты соединяются ковалентно. Эту реакцию выполняет фермент ДНК-лигаза, замыкающая фос-фодиэфирные связи. [c.128]

Лигаза фага Т4 (и бактериальная лигаза с крайне низкой скоростью) осуществляет еще одну реакцию — соединяет двунитевые фрагменты ДНК, содержащие ровные концы, образуя фосфоди-эфирные связи в обеих нитях. Скорость этой реакции на два порядка ниже скорости вышеописанной реакции. [c.175]

Рис. 5-78. Липкие концы, образующиеся под действием многих рестрицирующих нукле аз (см, рис, 4-63), обеспечиваюгт возможность соединения двух фрагментов ДНК за счет комплементарных взаимодействий. Фрагменты ДШС, соединившиеся таьсим путем, связываюгтся затем ковалентно в высокоэффективной реакции, катализируемой ДНК-лигазой, Здесь представлен случай образования рекомбинантной молекулы ДНК, состоящей из

Смотреть страницы где упоминается термин ДНК-лигаза соединяет фрагменты: [c.302] [c.43] [c.502] [c.428] [c.194] [c.199] [c.25] [c.38] [c.418] [c.276] [c.289] [c.53] [c.24] [c.37] [c.385] [c.95] [c.91] [c.305] [c.377] [c.289]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология