Ионообменная хроматография на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой

Рис. 4-46. Три типа матриксов, используемых для хроматографии. При ионообменной хроматографии (А) нерастворимый матрикс содержит ионы, задерживающие молекулы с противоположным зарядом. Для разделения молекул используются следующие матриксы диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза) - заряжена положительно карбоксиметилцеллюлоза (КМ-целлюлоза) и фосфоцеллюлоза - заряжены отрицательно. Силы взаимодействия между молекулами в растворе и ионообменником определяются ионной силой и pH элюирующего раствора, которые для достижения эффективного разделения можно варьировать определенным образом (как на рис. 4-47). При хроматографии по методу гель-фильтрапии (Б) матрикс инертен, но содержит поры. Низкомолекулярные соединения проникают внутрь частиц матрикса. Оказавшись при этом в относительно большем объеме, они проходят через колонку медленнее. В качестве матрикса можно использовать зерна поперечно-сшитого полисахарида (декстран или агароза). Поскольку в продаже имеются полисахариды с самым различным размером пор, их можно использовать для фракционирования молекул с молекулярной массой от 500 до 5 х 10 дальтон. При аффинной хроматографии (В) используется нерастворимый матрикс, ковалентно связанный со специфичными лигандами (антителами или субстратом ферментов), которые присоединяют определенный белок. Связываемые иммобилизованным субстратом молекулы фермента можно элюировать концентрированными растворами субстрата в свободной форме, а молекулы, связанные с иммобилизованными антителами, можно элюировать за счет диссоциации комплекса антитело антиген концентрированными растворами соли или растворами низкого или высокого pH. Однократная хроматография на такой колонке позволяет

Имеются сообщения я о неудачах пря использовании метода ионообменной хроматографии. Например, Т. Г. Орлова и Л. С. Дискипа [71] показали невозможность элюции вируса гриппа А2 (Краснодар) с колонки с ДЭЛЭ-целлю-лозой. Аналогичные результаты получили Лэвер [499] и Цвартов с сотр, [868]. При использовании хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе для очистки вируса болезни Тешена терялось до 99% вируса [481]. [c.125]

Очистка препарата тяжелого меромиозина с помощью ионообменной хроматографии. Для очистки фермента можно также воспользоваться методом колоночной хроматографии. Для этого супернатант после осаждения миозина и легкого меромиозина (15—30 мл) наносят на колонку (2x11 см) с ДЭАЭ-целлюлозой (ДЭАЭ-52, ватман), уравновешенную 50 мМ трис-НС1 буфером pH 7,9. После нанесения белка колонку промывают двумя объемами того же буфера. Белок элюируют линейным градиентом КС1 от О до 0,5 М (2x250 мл). [c.395]

Стадия 5. Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе, Вещество после стадии 4 наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюло-зой при значениях pH и ионной силы, обеспечивающих адсорб цию на колонке всех нуклеиновых кислот без связывания полимеразы. Эга стадия необходима потому, что небольшие количества нуклеиновых кислот, остающиеся после стадии 4, будут мешать адсорбции на фосфоцеллюлозе на следующей стадии. Свободный объем колонки собирают для использования на стадии 6. [c.220]

Как и в предыдущих разделах, мы попытаемся кратко рассмотреть применение ионообменной хроматографии на примере изучения белков сыворотки. До сих пор наиболее популярным методом разделения сывороточных белков является хроматография на колонке анионообменной ДЭАЭ-целлюлозы по методу Собера и Петерсона [18]. Предложено несколько модификаций этого метода. Фракции сыворотки элюируются с колонки различными способами градиентного элюирования и выходят обычно в следующем порядке IgG (как правило, имеет несколько пиков), р-, а-глобулины и затем альбумин. Этот метод особенно эффективен для приготовления препаратов IgQ высокой иммунохимической чистоты из нативной сыворотки. Его можно комбинировать с другими способами очистки, например с осаждением риванолом, Na2S04 и т. п. Подобным образом в качестве одного из этапов препаративного выделения анионообменная хроматография может применяться для очистки других белков сыворотки. При изучении структуры белка ее можно использовать для выделения и очистки полипептидов после расщепления белка ферментами или какими-либо другими веществами. [c.23]

Так, при очистке так называемого маннитол-специфичного фермента II Е. oli (входящего в состав системы фосфорилирования сахаров, переносимых через мембрану) для извлечения фермента из мембраны использовали 0,5%-ный раствор ДОХ. В его присутствии фермент сажали на колонку гексилагарозы. При элюции в раствор ДОХ добавляли еще и Луброл РХ до 0,5%. Этот детергент не только способствует элюции, но и необходим для проявления активности фермента, поэтому дальнейшую очистку — путем ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе — вели тоже в присутствии [c.185]

Поэтому до настоящего времени не нашли широкого распространения в области полисахаридов такие виды хроматографии, как распределительная и адсорбционная (отдельные примеры см." ). Более успешным оказалось применение ионообменной хроматографии для разделения кислых и даже нейтральных полисахаридов. Ионообменниками служат обы.ч,но аниониты, полученные модификацией целлюлозы, например ДЭАЭ-целлюлоза. Для элюирования полисахаридов с колонок используют растворы солей или буферные растворы разной концентрации прочно удерживаемые полисахариды элюируют разбавленными растворами щелочей. Таким споссбом легко удается отделить кислые полисахариды от нейтральных, например, пектиновую кислоту от сопутствующего ара-бинана или сульфированные полисахариды водорослей от крахмалоподобных примесей в ряде случаев при таком способе разделения удается освободиться от примесей белка. Нейтральные полисахариды можно разделить, применив ДЭ.ЛЭ-целлюлозу в боратной форме, при вымывании боратным буфером . Описано также успешное применение ЭКТЕОЛА- [c.486]

Схема разделения и очистки пептидов, описываемая ниже (включающая гельфильтрацию, хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе или дауэксе-50, высоковольтный электрофорез и хроматографию на бумаге), применима к белкам средней молекуляр-1ЮЙ массы (до 40 000). Крупные фрагмеггты, плохо разделяющиеся на бумаге и элюирующиеся с нее, первоначально отделяют гель-фильтрацией, а основную часть пептидов после фракцио- шрования на ионообменнике очищают окончательно хроматографией на бумаге. Однако эта схема применима далеко ие ко всем типам гидролизатов белков. Например, мембран11ые белки плохо расщепляются ферментами с высокой специфичностью, такими, как трипсин или стафилококковая протеаза гидрофобные пептиды склонны к образованию агрегатов при гель-фильтрации, осаждаются на ионообменных колонках и экстрагируются в охлаждающую среду при высоковольтном электрофорезе на бумаге и в органическую фазу при промывках в реакции Эдмана. Оптимальная схема анализа структуры мембранных белков включает их фрагментацию с помощью химических методов на небольшое число крупных пептидов, разделение в денатурирующих условиях на полиакриламидных гелях и определение аминокислотной последовательности автоматическим методом после присоединения пептида к твердой матрице. Альтернативный вариант основан на использовании протеаз с низкой специфичностью (таких, как пепсин или эластаза). При этом образуется значительное число коротких пептидов, которые [c.352]

Ионообменная хроматография удобна для отделения кислых полисахаридов от нейтральных. Принцип разделения основан на наличии в полисахаридах группировок, способных к ионизации и обусловливающих заряд соединения в целом. В качестве носителей (ионитов) применяют синтетические смолы, целлюлозы, дек-стран или агарозу, в которые введены катионные или анионные группы, дпэтил (2-оксниропил) аминоэтилдекстран, амберлит, дау-экс, ДЭАЭ-целлюлозу и др., последнюю — наиболее часто. Кислые полисахариды легко адсорбируются на колонках с ДЭЛЭ-цел-люлозой при pH около 6 и вымываются в зависимости от содер- [c.48]

Концентрацию жидкого бактериофага можно проводить методом ионообменной хроматографии с использованием волокнистой ДЭАЭ-целлюлозы. При этом профильтрованный бактериофаг разводят пополам стерильной дистиллированной водой и пропускают через хроматографические колонки с ДЭЛЭ-целлюлозой. Затем проводят элюцию бактериофага 0,7—1,0 М раствором Na l на 0,05 М фосфатном буфере (pH 7,0—7,4) с добавлением 1 % сер-. нокислого аммония. Концентрат стерильно собирают в емкости, добавляя в качестве стабилизатора 50 % обрата молока и 2 % глюкозы, а затем подвергают лиофилизации. В настоящее время бактериофаги выпускаются в широком ассортименте. [c.581]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология