Получение олигонуклеотидов

Принцип блочного метода определения последовательности показан на рисунке 175. Олигонуклеотид неизвестной структуры расщепляется двумя способами X и Y, различающимися по специфичности. При расщеплении по способу X образуются три олигонуклеотида, а по способу Y — два. Структуры всех полученных фрагментов устанавливаются соответствующим методом. Далее проводится сопоставление структур олигонуклеотидов У со структурами X с целью нахождения частично совпадающих (перекрывающихся) последовательностей и реконструкции таким образом исходной цепи. Поскольку каждый полученный олигонуклеотид представляет собой блок, из суммы которых строится исходная структура, метод называется методом перекрывающихся блоков. [c.309]

Совершенно очевидно, что если разделить все полученные олигонуклеотиды и для каждого из них определить концевое звено, противоположное меченому, то после расположения всех фрагментов в порядке возрастания длины можно реконструировать последовательность исходного олигонуклеотида. Таким -образом, проблема заключается в разделении продуктов и идентификации их концевых групп. [c.318]

Деметилирование (39) пиридином с последующей обработкой деметилированной соли фосгеном приводит к (37). Последовательная реакция (37) с двумя различными спиртами дает несимметричный фосфодиэфир (вероятными интермедиатами являются пятивалентные производные). Катализируемое гидроксид-ионом отщепление диметилацетоинового остатка от триэфира происходит по крайней мере в 10 раз быстрее, чем гидролиз триметилфосфа-та. Поскольку реагент (37) был применен лишь для синтеза модельных фосфодиэфиров, предполагали, что его можно использовать для получения олигонуклеотидов [49]. Однако реагент (37), подобно всем тетраэфирам пирофосфорной кислоты, очень чувствителен к действию воды и может быть использован только в абсолютно безводных условиях. Это значительное неудобство в области нуклеотидов, где субстраты часто лишь с трудом растворяются в безводных растворителях. [c.159]

В блочном методе определения последовательности нуклеиновых кислот весьма существенна методология структурного анализа. В одном из возможных вариантов используется полное расщепление полинуклеотидной цепи двумя (или более) ферментами с различной специфичностью. В случае РНК это может быть осуществлено различными рибонуклеазами, например гидролиз последовательно рибонуклеазой Т,, а затем — панкреатической рибонуклеазой. Структуры полученных олигонуклеотидов сравниваются для поиска перекрывающихся последовательностей Если это оказывается недостаточным, используется третья РНаза. [c.314]

Первые работы в СССР в области химии РНК и ДНК выполнены в Московском университете А. П. Белозерским, определившим нуклеотидный состав ДПК различных организмов. В лаборатории А. А. Баева в Институте молекулярной биологии АН СССР разработаны методы выделения индивидуальных т-РНК, расщепления их молекул и разделения полученных олигонуклеотидов установлено их строение. Дальнейшие ра боты но химии РНК, главным образом по онределеиию структуры РНК, модификации нуклеиновых кислот и выяснению зависимости функций РНК от структуры, проводились наряду с этим институтом также в Институте органической химии АН СССР в Новосибирске (Д. Г. Кнорре). В Институте биоорганических соединений АН СССР М. Н. Колосов с сотр. ведет исследования но изучению структуры и функций ДНК, синтезу функционально активных участков ДНК и химико-ферментативному синтезу нуклеотидов [90, с. 43]. [c.107]

Аналогичный подход — полимеризация три- или тетрануклео-тидного блока — был также использован для получения олигонуклеотидов с повторяющейся тринуклеотидной и тетрануклео-тидной 372 последовательностью. Для синтеза соединений такого типа часто применяется и другой подход, основанный на ступенчатом наращивании цепи олигонуклеотида. [c.88]

В случае реакции 1 энзим или катализатор ковалентно связан с полимером. Хорошо известно, что ионообменные полимеры с кислотными группами широко используют в качестве гетерогенных катализаторов. В качестве примеров можно привести кислотно-каталитические реакции фенола с ацетоном с образованием 4,4 -ди-гидроксидифенил-2,2 -пропана (бисфенола А) или алкилирование фенола олефинами. В реакциях типа 2 происходит взаимодействие низкомолекулярного соединения с полимером, содержащим функциональные группы, с переходом функциональной группы или электронов (редокс-полимеры). В случае твердофазного синтеза по Мерифилду [5, 6] имеет место ступенчатое образование поли-пептидных последовательностей с помощью реакционноспособных полимерных носителей. В конце реакции основная полимерная цепь разрывается. В случае длинных полипептидных цепей вследствие неколичественного взаимодействия/ возникает разнозвенность, которая приводит к необходимости искать другие пути синтеза с применением защитных групп. Развивается направление, связанное с использованием растворимых носителей [7]. Метод Мерифилда применяют ограниченно. В последние годы, правда, твердофазный синтез снова приобрел значение для получения олигонуклеотидов, так как он включает небольшое число стадий [8]. В качестве полимерных носителей используют наряду с кремниевым гелем полистирол [9—11] и гидрофильные набухающие полимеры [12, 13]. [c.79]

Использование панкреатической РНК-азы для получения олигонуклеотидов, оканчивающихся остатком цитидиловой кислоты, основано на предварительной реакции нуклеиновой кислоты с мето- п -голуолсульфонатом 1-циклогексил-З-[ 2-(морфолинил-4)-этил]-карбодиимида (СМСТ). При рН9 [c.293]

Была также изучена возможность применения метода с участием дициклогексилкарбодиимида и для синтеза некоторых высших полинуклеотидов. В первых работах были достигнуты удовлетворительные результаты при получении олигонуклеотидов, содержащих три-четыре мононуклеотидные единицы. Так, например, по реакции между тимидилил-(3 5 )-тимидином, защищенным соответствующим образом (полностью защищенный динуклеотид, каким он получается в результате первой стадии синтеза, подвергают мягкому щелочному гидролизу, причем происходит отщеиление только ацетильной, но не тритильной группы), и 3 -0-ацетилтимидин-5 -фосфатом [c.505]

Места ковалентных сшивок, а следовательно, и строение полученных олигонуклеотидов определяют методом ближайших соседей. Для этого 5 -концевые фосфатные группы олигонуклеотидных фрагментов метят изотопом 32р (например олигонуклеотиды 2 и 5, см. рис. 1.37). Полученные в результате лигазной реакции олигонуклеотиды (например, 4 и 6) после выделения и очистки подвергают полному гидролизу под действием фосфодиэстеразы и определяют, какой из нуклеотидов содержит 32р. Меченая фосфатная группа окажется у 3 -концевого мономера олигонуклеотида, к которому под действием ДНК-лигазы был присоединен 5 -концевой фосфат второго олигонуклеотида, и таким образом будет определено место сшивки. Если, например, при подобной обработке олигонуклеотидов 4 и 6 метка 32р окажется связанной с тимидином, то это однозначно подтвердит правильность присоединения исходных фрагментов. [c.60]

С разработкой триэфирного метода трудоемкость получения искусственных олигонуклеотидов значительно снизилась, и синтез олигомера постепенно превратился из экстраординарного в тривиальное событие. Принципиальное значение имели также появление технологии синтеза на полимерном носителе, заимствованной из химии пептидов и белков, и автоматизация процесса. Благодаря этому стало возможным почти целиком доверить получение олигонуклеотидов автоматическому синтезатору ДНК. Триэфирный метод позволил получать более длинные олигомеры (15-20 нуклеотидных звеньев), что привело к повышению стабильности комплексов из-за большего перекрывания олигонуклеотидов и дало возможность получать дуплексы-интермедиаты из большего числа олигомеров. Все это способствовало созданию значительно более протяженных генов при использовании прежней методологии. [c.64]

Огромный вклад в дело химического синтеза олигонуклеотидных блоков с заданной последовательностью внес уже упоминавшийся Х.Г.Корана, которому вместе с коллегами пришлось преодолеть многочисленные трудности. Так, 60-е и начало 70-х годов двадцатого столетия были периодом фосфодиэфирного синтеза, который позволил сдвинуть весь этот пласт, но оказался непригоден для широкого использования из-за своей крайней медлительности, поскольку средняя скорость нарагцивания олигонуклеотидной цепи этим методом составляла одно звено в месяц. Более того, осугцествить подобный процесс мог только высококлассный химик, обладавший к тому же адским терпением. С появлением в начале 70-х гг. фосфотриэфирного метода, скорость синтеза заметно возросла, что постепенно превратило процесс получения олигонуклеотидов в довольно рядовое событие. [c.12]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология