Иммуносорбенты для очистки антител

ПОЛУЧЕНИЕ ИММУНОСОРБЕНТОВ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ОЧИСТКИ АНТИТЕЛ [c.304]

Иммуносорбенты для очистке антител [c.109]

Очистка антигена. Цитозольную фракцию из мозга свиньи (с. 379) пропускают через колонку с иммуносорбентом (1x2 см) в фосфатном буфере (pH 7,4) и колонку промывают тем же буфером. Элюцию проводят 2 М глициновым буфером (pH 2,8), фракции нейтрализуют 2 М трис-НС1 буфером, pH 8,6 Определяют концентрацию белка, цАМФ-связывающую активность (с. 331) она не должна быть ниже 12 нмоль/мг. Проверяют чистоту полученного препарата регуляторной субъединицы (м. м.=56 ООО Да) методом электрофореза (с. 119). Таким же способом, имея моноклональные или поликлональные антитела к соответствующим антигенам, можно получить гомогенные препараты этих антигенов. [c.325]

Для приготовления иммуносорбента необходимо иметь очищенный антиген. Если речь идет о препаративном получении специфических антител, то без этого, очевидно, не обойтись. Однако при очистке относительно небольшого количества антител можно ограничиться разделением исходного клеточного экстракта, например методом электрофореза, и отделять специфические антитела из антисыворотки по их связыванию с зоной (полосой или пятном) антигена в геле. Удобнее для этой цели использовать не сам гель, а его реплику на диазобумаге [Остерман, 1981], где антигены фиксируются ковалентно. [c.112]

Цель задачи — исследовать эффективность очистки антител из антисыворотки на иммуносорбентах, полученных при иммобилизации глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы на препаратах сефарозы, активированных при разной концентрации Br N. [c.304]

ОЧИСТКА АНТИТЕЛ С ПОМОЩЬЮ ИММУНОСОРБЕНТОВ, ПОЛУЧЕННЫХ С ПРИМЕНЕНИЕМ БРОМАЦЕТИЛЦЕЛЛЮЛОЗЫ (ВАС) [79] [c.39]

М натрий-фосфатным буфером (pH 8,0). Доводят pH мышиной сыворотки до 8,0 с помощью 2М трис-основания добавляют равный объем фосфатного буфера, наносят смесь на колонку и медленно элюируют фосфатным буфером (5 мл/ч). Элюат содержит IgGs, который в значительной сте пеии загрязнен сывороточными белками, включая IgM и IgA. Для дальнейшей очистки IgGs необходим иммуносорбент с антителами к IgG, но выход при элюции в кислой среде невелик. [c.109]

Достаточным критерием иммунологической чистоты белка можно считать образование только одной полосы преципитации при двойной радиальной иммунодиффузии (см. ниже), когда с испытуемым очищенным белком взаимодействует поливалентная антисыворотка, полученная в ответ на введение животному неочищенного белка. Здесь уместно напомнить, что даже идеальная очистка белка-антигена не гарантирует строгой однозначности иммунного ответа. У разных особей данного вида животного введение одного и того же, совершенно чистого антигена может вызвать различные иммунные ответы. В одном случае это может быть гиперпродукция практически гомогенной специфической популяции антител, в другом — ответ может оказаться поливалентным, так что в антисыворотке появится целый набор антител, способных связывать исходный антиген (но не только его). Этот набор иногда можно разделить электрофорезом или ИЭФ. О причинах поливалентного иммунного ответа было подробно сказано выше. Ввиду такой возможности иммунизацию, как уже упоминалось, следует проводить параллельно на нескольких животных, с тем чтобы иметь возможность выбора наиболее чистой моноспецифической антисыворотки. После этих необходимых замечаний можно рассмотреть заключительный этап очистки антител — использование иммуносорбентов. [c.109]

Закрепление антигенов на твердой фазе носителя упоминалось выше при рассмотрении иммуносорбентов, используемых для очистки антител. Такие сорбенты можно использовать и для количественных оценок, например, для определения концентрации специфических антител в растворе, где их содержание еще слишком мало, чтобы его можно было выявить обычными прие-м ми титрования, описанными в части II. Такая задача возникает, например, в ходе отбора ( сканирования ) гибридбм, синтезирующих нужные антитела. Находящиеся в недостатке антитела из раствора полностью переходят на иммуносорбент, где их легко обнаружить с помощью радиоактивно меченного белка А. Если последний взять в избытке и дать ему надежно прореагиро- [c.287]

Использование белков-антигенов в качестве лигандов для очистки специфических антител на иммуносорбентах было описано в предыдущей книге этой серии [Остерман, 1983]. Там же была рассмотрена возможность связывания любых антител на матрице, несущей белок А из Staphylo o us aureus. Обе эти системы с полным правол можно включить в перечень аффинных хроматографических систем. Естественно, что иммуносорбенты используются и в обратном варианте, когда с помощью лигандов-антител производится очистка антигенов белковой природы пли гаптенов. [c.362]

Перечисленным требованиям соответствуют многие носители, в том числе и широко используемые в биохимических лабораториях для очистки и разделения белков. В связи с этим первоначально в гетерогенных методах ИФА применялись такие носители, как целлюлоза, сефароза, сефадекс, биогель, силохррм, пористое стекло, оксиды металлов. Эти материалы обладают высокой емкостью, легко подвергаются химической модификации, имеют хорошие гидродинамические свойства. Неорганические носители (силохром, пористое стекло) не подвержены воздействию микрофлоры, что позволяет использовать иммобилизованные, на них антитела длительный срок без применения консервантов. Одним из немногих (но существенных) недостатков гранулированных носителей является сложность их точного дозирования и трудность промывок без потерь используемых в анализе микроколичеств иммуносорбента. Особенно остро эти вопросы встают при необходимости проведения не единичных, а массовых анализов. [c.202]

Антитела к ферментам могут быть использованы для выделения фермента па иммуносорбенте. Это целесообразно как для очистки фермента, так и для удаления ого из реакционной смеси. Ферменты, фиксированные на сорбенте с иммобилизованными антителами против фермента, применяют с целью осуществчения гетерофазно о катализа. Существует ряд доводов в пользу применения иммобилизованных ферментов, в том числе фиксирован- [c.268]

Каждая молекула антитела специфична по отношению к той антигенной детерминанте, с которой она связывается, — таково представление о опецифичности в наиболее узком смысле. В отличие от этого специфичность антисыворотки определяется множеством специфичностей образующих ее антител. Антисыворотка связывается с одним определенным антигеном только в том случае, если совокупность специфичностей антигенсвязывающих центров всех антител в -сыворотке направлена на детерминанты лишь этого антигена. Однако, как правило, некоторые детерминанты являются общими для нескольких молекул антигенов, особенно если речь идет о сходных молекулах родственных видов животных. В этом случае некоторые из антител, образовавшихся в ответ на стимуляцию данным антигеном, могут связываться и с другими антигенами. Такие антитела называют перекрестно-реагирующими, а содержащую их антисыворотку — неспецифичной или перекрестно-реагирующей. Специфичность подобной антисыворотки можно повысить путем очистки на сорбенте, которую называют истощением сыворотки. В процессе истощения перекрестно-реаги-рующие антитела удаляются путем контакта с антигенами, которые обладают общими с индуцирующим антигеном детерминантами и преимущественно находятся в нерастворимой форме (иммуносорбент). [c.21]

Иммуносорбенты — для удаления перекрестно реагирующих антиизотипических антител, для аффинной очистки антиглобулинов. [c.105]

Доступность моноклональных антител в достаточно больших количествах позволяет использовать другой метод очистки подклассов IgG (так же как IgM, IgA и, IgE)—аффинную хроматографию на колонках с иммуносорбенто м. Процедуры аффинного связывания и элюции рассмотрены в гл. 5. [c.110]

Глутаровый альдегид можно использовать в качестве сшивающего реагента для полимеризации антигенов и антител. Сшитые белки становятся нерастворимыми вблизи своей изоэлектрической точки (pH 4,5—7,5). Нерастворимые перекрестно-сшитые белки стабильны в растворах мочевины и додецилсульфата натрия и могут быть использованы как иммуносорбенты для очистки соответствующих антигенов или антител с помощью колоночной или бесколоночной хроматографии. Метод не требует больших затрат времени, воспроизводим и может быть использован для всех белков, содержащих свободные а- или е-аминогруппы (Avrameas, Ternyn k, 1969). [c.73]

Очищенная таким образом антисыворотка полиспецифична (поливалентна), хотя может быть и очень сильно обогащена антителами одной определенной антигенной специфичности. Если этого недостаточно, то для дальнейшей очистки моноспецифиче-ских антител используют иммуносорбенты. [c.109]

Посадив на Protein A-Sepharose моноспецифические антитела, можно получить иммуносорбент, пригодный для очистки соответствующего антигена. В интересах надежного и многократного использования такого иммуносорбента относительно [c.276]

Хроматографическая очистка, основанная на истинной биоспецифической аффинности исключительно к выделяемому белку, достигается при использовании иммуносорбентов. В литературе описано применение такого сорбента для очистки рестриктазы E oR 1 [9]. Авторы этой работы проводили сорбцию фермента на колонке с антителами к E oR I, иммобилизованными на сефарозе 4В, непосредственно из бесклеточных экстрактов. В результате последующей элюции в одну стадию удалось получить гомогенный препарат фермента. Широкому применению иммуносорбентов препятствует то, что для иммунизации необходимо располагать гомогенными препаратами рестриктаз. [c.157]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология