Нуклеаза бактериальная

Этот первый метод выделения генов был разработан в конце 1960-х — начале 1970-х гг. Его появление стало возможным благодаря открытию ферментов, называемых рестрикционными (от англ. restri ting — ограничивающий) эндонуклеазами или рестриктазами. Эти ферменты обнаруженные в бактериях, способны разрезать ДНК, например они разрезают любую вторгающуюся в бактериальную клетку вирусную ДНК, ограничивая (рестрицируя) таким образом размножение вирусов внутри клетки. Разные виды бактерий продуцируют различные рестрикционные эндонуклеазы. Каждая из них разрезает нуклеиновую кислоту (отсюда, нуклеаза ) в строго определенных точках ( эндо означает, что фермент разрезает молекулу изнутри, а не атакует ее с концов). Фермент распознает некую последовательность оснований и взаимодействует именно с ней. Точки разрезания называются сайтами рестрикции. К настоящему времени выделено более 2000 рестриктаз, активных в отнощении 230 разных последовательностей. Свою собственную ДНК бактерия защищает путем присоединения к определенным основаниям в сайтах рестрикции метильной группы. [c.219]

Гидролизующий полинуклеотиды бактериальный фермент, который широко используется для анализа ближайших соседей (гл. 2, разд. 3,4), может осуществлять гидролиз ДНК и РНК до З -нуклеотидов. Установлена трехмерная структура молекулы нуклеазы стафилококков, состоящей из 149 аминокислотных остатков [69—71]. Так же как и в случае панкреатической рибонуклеазы, молекулу нуклеазы стафилококков можно расщепить на два активных пептида (фрагменты, построенные из остатков 6—48 и 49—149), которые, соединяясь, образуют комплекс, обладающий ферментативной активностью [71, 72]. Комплекс образуется даже в том случае, когда от меньшего пептида отщеплены остатки 43—48. Однако остаток 01и-43, который связывает имеющий существенное значение ион Са +, необходим для проявления ферментативной активности [72], так же как и пептидная связь с соседним треонином (Тге-44). [c.124]

Рестрикционные нуклеазы. являются бактериальными эндонуклеазами, которые узнают специфическую последовательность оснований, обычно от четырех до шести остатков длиной, обладающую центром симметрии [27]. Фермент действует таким образом, что разрывает обе цепи симметрично по отнощению к этому центру (табл. 22.4.1). Состав различных узнаваемых последовательностей регулирует частоту, с которой они появляются в больщих молекулах ДНК- Напрнмер, E o R1, из Е. соИ делает один разрыв в молекуле ДНК вируса % (5000 пар нуклеотидов), тогда как Мае 11 , из Haemophilus aegyptius расщепляет ту же ДНК в 17 местах. [c.192]

Уже давно было известно, что в бактериальной ДНК среди миллионов обычных оснований (А, Т, G и С) встречаются основания, несущие дополнительные метильные группы. Биологическое значение этих метилированных оснований стало понятным в результате ряда важных открытий, которые оказали большое влияние на развитие генетики и, в частности, биохимической генетики. Для каждого вида бактерий характерна своя особая картина распределения метилированных оснований по ДНК, отличающая ее от ДНК других видов. Если ДНК какого-либо другого вида каким-то образом проникнет в живую бактериальную клетку, то она будет признана там чужеродной именно по отсутствию в ней специфической для данного вида картины распределения метилированных оснований, присущей ДНК клеток этого вида. В такой ситуации чужеродная ДНК будет разрушена специфической нуклеазой, которая расщепляет обе цепи ДНК непосредственно в том месте, где отсутствуют характерные для ДНК клетки-хозяина метилированные основания, или вблизи этого места. Таким образом чужеродные ДНК подвергаются рестрикции они разрушаются с помощью специфических ну-клеаз, вырабатываемых каждым видом бактерий. [c.880]

Нуклеазы — это большая группа ферментов, катализирующих реакцию гидролиза молекул нуклеиновых кислот. В результате действия нук-леаз молекула ДНК или РНК распадается на фрагменты или отдельные нуклеотиды. Исходная функция нуклеаз в клетке — деградация ненужных в данный момент жизнедеятельности молекул (например, деградация мРНК после трансляции) и защита от чужеродных молекул нуклеиновых кислот (расщепление фаговой ДНК бактериальными нуклеазами при заражении бактерии фагом). [c.25]

Многие рестрицирующие иуклеазы вносят разрывы в две цепи ДНК со смещением на несколько нуклеотидов, так что на концах фрагментов образуются короткие одноцепочечные участки. Эти одноцепочечные концевые участки обладают способностью образовывать комплементарные пары оснований с любым другим одноцепочечным участком, полученным с помощью того же фермента, и потому их называют липкими концами (рис. 4-63). Липкие концы, образованные рестрикционными ферментами, позволяют легко соединить два любых фрагмента ДНК воедино при условии, что эти фрагменты образовались после действия одной и той же рестрицирующей нуклеазы (рестриктазы) (либо иной нуклеазы, которая создает такие же липкие концы). Таким образом, фрагмент ДНК любого происхождения можно встроить в очищенную ДНК автореплицирующегося генетического элемента, которым, как правило, является плазмида или бактериальный вирус. Бактериальный клон, содержащий такую плазмиду или вирус, можно сравнить с фабрикой по производству этого фрагмента ДНК. Исходный фрагмент может происходить прямо из геномной ДНК, или из к ДНК (комплементарной ДНК), т. е. из ДНК, полученной копированием матричной РНК. Эти методы детально обсуждаются в гл. 5. [c.231]

Еще одно свойство рестрицирующих нуклеаз делает их удобным инструментом для клонирования генов. Многие из них вызывают ступенчатые разрывы, вследствие чего на обоих концах фрагмента ДНК образуются короткие одноцепочечные хвосты . Их называют липкими концами, потому что они способны к комплементарном взаимодействию с любым другим конном, образовавшимся под действием того же фермента Благодаря липким концам, образуемым рестрицирующей нуклеазой, два фрагмента двойной спирали ДНК, происходящие из разных геномов, могут соединиться в одно целое путем спаривания оснований (рис. 5-78). Можно, например, присоединить in vitro фрагмент ДНК, содержащий какой-нибудь ген человека, к хромосоме вируса бактерий и полученную таким путем новую рекомбинантную молекулу ДНК ввести затем в бактериальную клетку. Начав с одной этой рекомбинантной молекулы ДНК, инфицировавшей одн бактериальную клетку, репликационная машина вируса может менее чем за сутки выработать свыше 10 идентичных молекул вирусной ДНК. а значит, точно в такой же мере размножить и присоединенный к ней фрагмент ДНК человека. Вирус, используемый для подобной цели, называют клонирующим вектором. [c.327]

В две контрольные пробирки вносят фрагментированную нативную ДНК из спермы лосося (не имеющую гомологии с бактериальной ДНК) для измерения степени саморенатурации меченых фрагментов. Четыре пробирки используют для гомологичной реассоциации и две — для каждого из препаратов гетерологичных ДНК. Пробирки инкубируют в течение 20—24 ч при температуре на 25 °С ниже Тт ДНК-стандарта Тт определена в буфере SS ). После инкубации из каждой пробирки отбирают по 100 мкл препарата для определения степени реассоциации с помощью гидроксилапатита или нуклеазы S1 (см. ниже). [c.142]

Один из важнейших инструментов генной инженерии—эндонуклеазы, ферменты, расщепляющие ДНК по специфическим последовательностям нуклеотидов внутри цепи (в противоположность экзо-нуклеазам, которые расщепляют ДНК с концов молекулы). Эти ферменты получили название рестрик-таз, поскольку их присутствие в бактериальной клетке ограничивает рост определенных бактериальных вирусов, называемых бактериофагами. Рестриктазы расщепляют ДНК на относительно небольшие фрагменты в участках последовательности строго определенной структуры. Этим их воздействие отличается от большинства других ферментативных, химиче- [c.36]

Пурины и пиримидины доступны для микроорганизмов после гидролитического расщепления нуклеиновых кислот и их компонентов - нуклеотидов и нуклеозидов нуклеазами. В отличие от белков, нуклеиновые кислоты используются немногими бактериями. Бактерии, минерализующие нуклеотиды, высвобождают содержащиеся в них остатки фосфорной кислоты, обогащая почву фосфатами. Этот процесс особенно активно осуществляется бактериями Вас. megaterium var. phosphati um, на основе которых получают бактериальный препарат, применяемый для обогащения почвы фосфором. [c.429]

Бактериальные и грибные протеиназы используются для расщепления белков, причем расщепление может быть фрагментарным. Например, субтилизин при коротком воздействии на рибо-нуклеазу расщепляет только одну пептидную связь этого белка. Карбоксидопептидаза дрожжей постепенно расщепляет белки, отделяя одну за другой аминокислоты с карбоксильного или аминного конца. [c.376]

Ген, клонированный в плазмиде, расщепляют по уникальному сайту рестрикции и образовавшиеся линейные молекулы ДНК инкубируют в присутствии экзонуклеазы Ва13. При этом экзонуклеаза последовательно удаляет нуклеотиды с обоих концов ДНК, причем количество удаляемых нуклеотидов прямо пропорционально времени инкубации ДНК с нуклеазой, а также зависит от температуры инкубации и концентрации фермента. В результате подобного действия образуется набор фрагментов ДНК разной длины, содержащих делеции различных размеров по обе стороны выбранного сайта рестрикции. К тупым концам Таких молекул ДНК с помощью ДНК-лигазы присоединяют Двухцепочечные олигонуклеотидные линкеры, содержащие уникальный (часто исходный) сайт рестрикции, обрабатывают соответствующей рестриктазой, замыкают молекулы в кольцо по- едством лигирования и затем вводят их в бактериальные клетки. Точное картирование концов делеций осуществляют секвени-рованием соответствующих участков ДНК мутантных плазмид. В результате получают набор делеций разного размера, положе- [c.287]

Пептидные аптамеры представляют собой искусственно полученные короткие 15-30-звенные аминокислотные последовательности, встроенные генно-инженерными методами в полипептидную цепь белка-носителя, которые обладают способностью специфически распознавать и взаимодействовать с высоко- или низкомолекулярными соединениями. В качестве белка-носителя, чаще всего, используют бактериальный тиоредоксин [298], однако в последнее время разработаны аналогичные системы на основе зеленого флуоресцирующего белка (GFP) [299] и нуклеазы стафилококков [300]. Таким образом, пептидные аптамеры представляют собой гибридные белки, в которых полипептидная цепь белка-носителя выполняет скелетную функцию, обеспечивая правильное пространственное расположение пептида-рецептора на поверхности белковой глобулы носителя, а также стабильность пептида и высокий уровень его экспрессии во внутриклеточном окружении. [c.433]

Так как рестриктазы расщепляют ДНК на ограниченное число фрагментов, они нашли применение для определения первичной структуры ДНК. Однако еще бо.ттее важная область их практического использования — генетическая инженерия, так как именно благодаря действию рестриктаз из ДНК выщепля-ются фрагменты, которые далее встраиваются в бактериальную ДНК, становятся интегральной частью бактериального генома и приносят бактерии новые, не свойственные ей ранее биохимические признаки, такие, например, как способность синтезировать интерферон, инсулин и другие белки, находящие широкое применение в медицине (рис. 81). В принципе, такие процессы возможны и в геноме высших организмов. Легкое встраивание рестрикционных фрагментов ДНК в реципиентную ДНК (т. е. ДНК, включающую эти фрагменты в свой состав) объясняется тем, что при действии рестриктаз в точке разрыва молекулы ДНК получаются липкие , комплементарные концы. Ввиду огромной теоретической ценности и большого практического значения этих работ в нашей стране начиная с 1975 г. осуществляются комплексные исследования по проекту Рестриктаза , который планируют на последующих этапах работы превратить в более широкий проект Нуклеаза и привлечь к его разработке различные научно-исследовательские институты. В 1980 г. большая группа советских ученых была удостоена 1осударственной премии за разработку регламентов получения 30 рестриктаз и внедрение их в практику работ по генетической инженерии. [c.226]

Количество информации, которую вирус привносит в инфицируемую клетку, чтобы обеспечить себе воспроизведение, различается у разных вирусов весьма заметно. Так, в ДНК сравнительно крупного бактериофага Т4 закодировано не менее 30 различных ферментов, обеспечивающих избирательную и быструю репликацию хромосомы бактериофага Т4 в ущерб репликации ДЕЖ клетки-хозяина, т. е. Е. oh (рис. 5-72). Эти белки участвукл в непрерывных циклах репликации Т4-ДЕЖ и осуществляют избирательное включение 5-гидроксиметилцитозина, который в Т4-ДЕЖ замещает цитозин. В геноме бактериофага Т4 закодированы также и нуклеазы, избирательно разрушающие ДЕЖ Е. oh (геном самого бактериофага из-за необычного состава оснований не подвержен действию этих нуклеаз). Кроме того, в нем закодированы белки, изменяющие молекулы бактериальной РНК-полимеразы таким образом, что они на разных стадиях инфекции транскрибируюгт различные группы генов бактериофага. [c.316]

Процесс, который мы обсуждали до сих пор, называется общей генетической рекомбинацией, поскольку обмены могут происходить между любыми парами гомологичных последовательностей в родительских молекулах ДНК. У Е. соИ общая рекомбинация зависит от генов гес. В клетках гес бактериальная ДНК не может рекомбинировать с экзогенными молекулами ДНК. Были идентифицированы три гена гес. гесА, гесВ и гесС. Белки тесВ (масса 140 Да) и тес С (128 кДа)-две субъединицы одной нуклеазы, которая расплетает двухспиральную ДНК и расщепляет на куски сначала одну из расплетенных цепей, а затем дру- [c.200]

Смотреть страницы где упоминается термин Нуклеаза бактериальная: [c.329] [c.329] [c.385] [c.293] [c.385] [c.310] [c.316] [c.327] [c.176] [c.102] [c.208] [c.116] [c.146] [c.187] [c.280] [c.344] [c.259] [c.141] [c.231] [c.327] [c.327] [c.176]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология