ДНК-специфические экзонуклеаз

Экзонуклеаза III —ДНК-специфическая фосфатаза. В небольших количествах обнаружена в клетках кишечной палочки и, как правило, ассоциирована с ДНК-полимеразой. Действие этого фермента весьма напоминает действие экзонуклеазы II, но экзонуклеаза III к тому же характеризуется высокоспецифичной фосфатазнойак- [c.88]

Расщепление нуклеиновых кислот под влклнием специфических ферментов — эндо- и экзонуклеаз — сопровождается разрывом фосфо-диэфирной связи и образованием продуктов различной величины, которые могут быть разделены методами электрофореза и хроматографии. Это широко используется при анализе последовательности нуклеотидов в молекулах РНК и ДНК., Особое значение при развитии генной инженерии получило расщепление ДНК специфическими эндонуклеазами (рестриктазами), позволяющее получать отрезки ДНК определенной длины и нуклеотидного состава. > [c.175]

Практически все виды бактерий синтезируют но одному или по несколько типов специфических к определенной нуклеотидной последовательности эндонуклеаз, которые делают разрезы в двухцепочечной ДНК. Эти эндонуклеазы называются рестрицирующими ферментами (или рестриктаза-ми), поскольку их основная функция состоит, но-видимому, в ограничении присутствия инородной ДНК в бактериальной клетке (рестрикция буквально означает ограничение). ДНК клеток, синтезирующих ферменты рестрикции, защищена от их действия, потому что клетки синтезируют также модифицирующие ферменты, видоизменяющие структуру сайтов ДНК, узнаваемых ферментом рестрикции. Если клетка с действующей системой рестрикции и модификации инфицируется фагом с заранее не модифицированной ДНК, то вероятность того, что ДНК такого фага инициирует инфекцию, на несколько порядков меньше, чем для фага с модифицированной ДНК. Немодифицированная ДНК фрагментируется, число фрагментов зависит от числа сайтов узнавания в соответствующей молекуле ДНК, а затем фрагменты расщепляются экзонуклеазами. Изредка ферменты клетки-хозяина модифицируют фаговую ДНК до того как ее атакуют рестриктазы. В этом случае фаговая инфекция приводит к лизису клетки. Все потомки такого фага содержат тоже модифицированную ДНК и способны с высокой эффективностью заражать другие бактериальные клетки (с такой же системой рестрикции и модификации). Изучение закономерностей фаговой инфекции и привело к открытию систем рестрикции и модификации ДНК и разработке методов получения чистых препаратов соответствующих ферментов. [c.266]

Дезоксирибонуклеазы (К-Ф.3.1.4.5) — собирательное название многих с различной степенью специфичности гидролизующих ДНК ферментов. Их можно разделить на две группы эндонуклеазы и экзонуклеазы. Эндонуклеазы весьма условно также делятся на две группы — ДНК-аза I и ДНК-аза П. Действие ферментов первой группы приводит к образованию из ДНК дезоксинуклеозид-5 -фосфатов. Действие второй группы заканчивается образованием дезоксинуклеозид-З -фосфатов. Со временем все очевиднее становится условность такого разделения, поскольку между этими двумя крайними случаями обнаруживается большая часть других ферментов этого класса. В настоящее время описано много ДНК-специфических эндонуклеаз различного биологического происхождения. Большой теоретический и практический интерес среди них представляют так называемые рестриктазы — эндонуклеазы, которые весьма специфически, в зависимости от нуклеотидной последовательности расщепляют ДНК- Такими являются, например, бактериальные эндонуклеазы, способные расщеплять вирусную ДНК, отличающуюся от ДНК хозяина характером структурной модификации. [c.48]

Нуклеазы могут специфически катализировать гидролиз ДНК или РНК, а также соответствующих полинуклеотидов. Эти ферменты подразделяются на два типа 1) экзонуклеазы, для действия которых необходимо наличие свободного конца цепи, и 2) эндонуклеазы, которые не нуждаются в наличии свободного конца цепи и могут атаковать одну или несколько связей в любом месте полинуклеотида. [c.217]

УТФ+NHs-f АТФ - ЦТФ-f АДФ-ЬФ н ЦЦА-пирофосфорилаза — РНК-специфическая экзонуклеаза хронического действия. В очищенном виде этот фермент выделен из клеток кишечной палочки. В присутствии неорганического фосфата он отщепляет от З -гидроксильного конца тРНК последовательность концевых нуклеотидов ЦфЦфА, в результате чего образуется ЦТФ и АТФ. Реакция легко обратимая, и отщепление обоих нуклеотидов, видимо, катализируется одним и тем же ферментом. [c.88]

Межнуклеотидные связи в ДНК и РНК можно химически расщепить с помощью гидролиза. Их можно гидролизовать и ферментами, которые называются ну-клеазами. Некоторые нуклеазы способны расщеплять связи между двумя соседними нуклеотидами, расположенными внутри цепи ДНК или РНК такие нуклеазы называют эндонуклеазами. Нуклеазы другого класса могут катализировать гидролиз только связи концевого нуклеотида-или у 5 - или у 3 -конца молекулы эти ферменты относятся к экзонуклеазам. Дезоксирибонуклеазы, специфически расщепляющие определенные межнуклеотидные связи в ДНК, и рибонуклеазы ферменты, специфичные к РНК, найдены во всех живых клетках. Они секретируются, в частности, поджелудочной железой в кишечный тракт, где принимают участие в гидролизе нуклеиновых кислот в процессе пищеварения. Ниже мь1 увидим, что различные типы эндонуклеаз представляют собой важный биохимический инструмент для контролируемого расщепления ДНК и РНК на меньшие фрагменты при определении их нуклеотидной последовательности. [c.857]

Рестриктазы — специфические бактериальные эндонуклеазы, которые в зависимости от последовательности нуклеотидов расщепляют чужеродную ДНК, омичаю-щуюся по характеру строения от ДНК хозяина. Для появления-вктивности очищенного препарата рестриктазы из Кишечной палочки (ее" раньше называли экзонуклеазой П1) необходимо наличие ионов АТФ и 5-аденозилметионина. Этот фермент, [c.74]

Экзонуклеазы ДНК специфические — ферменты, в результате гидролитического действия которых на ДНК образуются мононуклеотиды. Они осуществляют последовательное отщепление дезоксирибонуклеотидов с какого-либо конца цепи. Экзонуклеазы гидролизуют фосфодиэфирные связи, поэтому их называют фосфодиэсте разами. [c.88]

У таких бактерий, как Е. соИ, деление происходит каждые 30 мин, поэтому у них сравнительно легко выявить в большой популяции клеток редкие экземпляры с измененными нризнаками. Выделен, например, класс мутантов, характеризуюш,ихся резким повышением частоты спонтанных мутаций, что связано с присутствием в его клетках специфических геиов-мутаторов. Известен ген-мутатор, кодируюш,ий дефектную форму 3 5 -корректирующей экзонуклеазы, представляющей собой субъединицу ДНК-нолимеразы (см. разд. 5.3.3). Если дефект затрагивает этот белок, то ДНК-полимераза утрачивает способность эффективно осуществлять коррекцию и в ДНК накапливается много ошибок, которые при нормальной ренликации были бы устранены. [c.295]

Как цитозиновые, так и адениновые основания спонтанно дезаминируются с образованием урацила и гипоксантина соответственно. Поскольку в норме ДНК не содержит ни урацила, ни гипоксантина, нет ничего удивительного в том, что специфические N-гликозилазы узнают эти аномальные основания и удаляют нх. Образовавшийся разрыв служит сигналом для действия репарационных пурин- или пи-римидинспецифичных эндонуклеаз, расщепляющих фосфодиэфирную связь возле соответствующего участка повреждения. После этого при последовательном действии экзонуклеазы, репарационной ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы происходит заполнение бреши и восстановление исходной правильной структуры (рис. 38.22). Эта цепь событий получила название эксцизионной репарации. Сходным образом происходит процесс репарации ДНК, содержащей алкилированные основания и аналоги оснований. [c.80]

Другой подход — это выявление в ядерных экстрактах белков, способных специфически связываться с определенными участками ДНК. Для этого экстракты, выделяемые обычно из ядер с помощью 0,2—0,4 М солевых растворов, инкубируют с клонированными фрагментами меченой ДНК в присутствии избытка немеченой неспецифической ДНК (например, из Е. oli). Комплексы ДНК с белками выявляют либо путем их сорбции на нитроцеллюлозных фильтрах, либо наблюдая замедление миграции данного, фрагмента при гель-электрофорезе. Зная рестриктный фрагмент, с которым специфически взаимодействуют белки ядерного экстракта, можно далее выявить участки этого фрагмента, защищаемые связанным белком от атаки нуклеазами (ДНКазой I, экзонуклеазой) или химическими агентами (например, диметилсульфатом). Для этого после мягкой обработки расщепляющими агентами фрагменты ДНК (меченные предварительно по одному концу) разделяют с помощью электрофореза в геле вместе с обработанными тем же методом препаратами свободной ДНК. Сравнивая полученные наборы продуктов расщепления, легко определить участки ДНК, защищаемые белком с точностью до одного нуклеотида (рис, 31), [c.168]

Вначале имелись лишь косвенные данные о том, что терминация в указанных выше сайтах происходит при связывании неких белков со специфическими последовательностями ДНК. Эти данные получили подтверждение после того, как в экстрактах ядер были обнаружены белковые факторы, связывающиеся с терминирующей последовательностью размером 18 п.н. Связывание белков-лигандов с терминирующей последовательностью идентифицировали по защите 5 -меченого фрагмента, содержащего эту сигнальную последовательность, от расщепления экзонуклеазой III (рис. 8.17). Расщепление происходило только до тех пор, пока фермент не встречал на своем пути связанный белок. Напомним, что экзонуклеаза III расщепляет фрагменты двухцепочечной ДНК, начиная с З -концов (табл. 4.1). В результате образуются цепи ДНК с мечеными 5 -концами. причем их длина определяется тем, в каком месте связанный белок останавливает экзо-нуклеазное расщепление. Поскольку 5 -конец каждой цепи фрагмента можно пометить независимо, нетрудно установить границы защищенного участка. В опытах такого рода с сегментами, содержа- [c.36]

У эукариот, дальнейшая модис )нкация мРМК касается 5 -кон-ца, где может достраиваться специфическая группировка из нескольких оснований ( кеп ), служащих, но-видимому, для защиты от экзонуклеаз и новьпнающих эффективность трансляции. [c.43]

Химический мутагенез. Для получения точечных мутаций в определенном участке молекулы чаще всего используют дуплексную кольцевую ДНК, содержащую короткий одноцепочечный участок. Один из способов создания таких сайт-специфических пробелов состоит в обработюг сверхспиральной ДНК соответствующей рестриктирующей эндонуклеазой в присутствии бромистого этидия, который встраивается между плоскостями пар оснований и вносит нарущения в структуру дуплекса (рис. 7.33, А). При этих условиях многие рестриктирующие эндонуклеазы разрезают только одну из цепей в соответствующих сайтах. По-видимому, при встраивании бромистого этидия в обычную дуплексную молекулу ДНК разрезания вообще не происходит, а в сверхспиральной молекуле разрезается только одна цепь. Не все рестриктирующие эндонуклеазы ведут себя подобным образом, но все же число их достаточно велико. После разрезания молекулы с помощью экзонуклеазы в дуплексной молекуле создают небольшой одноцепочечный пробел в месте разреза. Альтернативный способ полу- [c.344]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология