Карбоксипептидаза действие в растворе

Однозначная идентификация С-концевого остатка оказывается возможной при применении нового метода, предложенного Ковальским и Бойером [12] метод этот основан на действии карбоксипептидазы в растворе HjO . Как следует из схемы, приведенной ниже, аминокислота, освобождающаяся с С-конца, не содержит избытка О , в то время как внутренние остатки будут содержать избыток включившегося из Н,0 . [c.190]

Пепсин действует в кислой среде (pH = 1—2). Активность пепсина очень велика 1 г кристаллического пепсина за 2 часа расщепляет и переводит в раствор 50 кг денатурированного яичного белка. Трипсин гидролизует белки и продукты его распада в слабощелочной среде (pH = 8—9). Пептидазы действуют при pH = 7,1—7,6. Известны три группы пептидаз карбоксипептидазы и амино-пептидазы, гидролизующие пептиды, содержащие не менее трех аминокислотных остатков (стр. 687), и дипептидазы, расщепляющие дипептиды. [c.703]

Большинство аминокислот или свободного а-аминного азота сусла высвобождается при солодоращении, а не при затирании, но расщепление белков в ходе затирания продолжается и проходит две стадии. На первой стадии они растворяются, после чего происходит гидролиз до пептидов, которые по ходу протеолиза уменьшаются в размерах. На второй стадии пептиды преобразуются в аминокислоты (преимущественно под действием карбоксипептидазы) [27]. По разным оценкам, в обычном солодовом сусле около 60% всех белковых веществ присутствует в виде аминокислот, 20% — в виде пептидов, а еще 20% представляют собой полипептиды с высокой молекулярной массой, способные вызывать в пиве образование мути. [c.34]

Рис. IV—4. Количественные закономерности прямого действия радиации в водных растворах А — зависимость числа инактивированных молекул карбоксипептидазы от концентрации раствора (по Дэйлу и др., 1949) Б — зависимость радиационно-химического выхода (О) однонитевых разрывов от концентрации ДНК по Коллинсу и др., 1965)

Определение. 0,5—1 мкмоль белка растворяют в 10—20 мл воды и осаждают на холоде, добавляя трихлоруксусную кислоту до конечной концентрации 5%- Осадок промывают 5%-ным раствором трихлоруксусной кислоты, а затем 3—4 раза ацетоном для удаления ее следов. Указанные стадии позволяют удалить свободные аминокислоты, которые могут загрязнять препарат белка, и приводят к денатурации белка, повыщающей доступность С-концевых аминокислот к действию карбоксипептидаз. При определении С-концевых аминокислот в пептидах первые стадии необходимо опустить. Промытый осадок белка или пептид растворяют в 0,2 М аммоний-бикарбонатном буфере или в [c.155]

Степень инактивации в некоторых случаях не является независимой от концентрации субстрата [уравнение (26 а)] даже при допущении, что инактивированные молекулы служат самозащитой для субстрата. Дейл, Грей и Мередит [44] нашли, что Язт/Зо [см. уравнение (47)] при инактивации карбоксипептидазы рентгеновскими лучами остается постоянным в широком пределе значений 5п от 0,12 до 0,0001 г/г раствора при дальнейшем падении концентрации фермента ниже 1 10 г азт/ о заметно возрастает, Данные Дейла с сотрудниками [44] представлены на рис. 45. Величина Р.гт/Зд остается постоянной в широких пределах значений 5о, что является замечательным подтверждением теории косвенного действия. Отклонения при очень низких концентрациях, вероятно, могут быть приписаны рекомбинации радикалов растворителя [см. уравнение (32)]. Уменьшение числа радикалов в этом случае, по-видимому, увеличивает дозу облучения, необходимую для инактивации. [c.242]

В гл. IV мы показали на двух примерах (см. стр. 148), что с помощью сефадекса G-25 можно определить число центров связывания в молекуле фермента, или сродство ферментов к различным реагентам, а также изучить влияние кофакторов на фермент (см. стр. 142). Аналогичным образом, измеряя способность к связыванию восстановленного ДПН, удалось найти эквивалентный вес семи дегидрогеназ (30 000— 40000) [20]. Иногда образуются стабильные комплексы фермента с реагентом, как, например, при действии свободной от цинка карбоксипептидазы на пептидный субстрат [21]. Этот комплекс, который с помощью гель-хроматографии можно отделить от избытка субстрата, уже не активируется ионами цинка. Очистка гель-фильтрацией на сефадексе G-50 является стандартным приемом при определении металла в карбоксипепти-дазе [22]. Лизоцим образует нерастворимый комплекс с продуктом, получающимся при действии этого фермента на- определенный гликопептид. Растворение этого комплекса (в растворе Na l) и последующий анализ с помощью гель-хроматографии на сефадексе (j-75, а затем на G-25 дает информацию о кинетике ферментативной реакции [23]. При добавлении цито-хромоксидазы к избытку цитохрома с и последующем разделении на сефадексе G-200 в некоторых случаях получают высокомолекулярную фракцию, содержащую эквимолярные количества обоих ферментов эта фракция есть по сути не что иное, как часть дыхательной цепи [24]. В некоторые ферменты цикла лимонной кислоты, для которых кофактором служит биотин, удалось ввести метку (С Ог) в результате реакции с соответствующими субстратами с последующей очисткой на сефадексе G-50 это дало возможность после деградации под действием проназы [c.214]

Кроме того, вследствие мутаций в каждой из цепей гемоглобина возможна замена по крайней мере одной аминокислоты. В настоящее время известно около 100 таких мутантов [94, 170]. Изменения в составе гемоглобина можно произвести и искусственно (см. работу 18]) различными способами 1) путем образования гибридов с использованием а- и -цепей из гемоглобйнов различных видов 2) в результате протеолитического переваривания С-концевых остатков под действием карбоксипептидазы и 3) химическим модифицированием, например, сульфгидрильных групп цистеиновых остатков. Можно, разумеется, изменять валентность железа, а также природу шестого лиганда в координационной сфере железа, и даже удается получить гемоглобины, в которых состояние железа в каждой из цепей различно, например, путем смешивания растворов N- и 02. Из многих гемоглобйнов и миоглобинов удается удалить без денатурации белка железопорфириновый комплекс, а затем реконструировать полный белок из белка и порфиринового комплекса, взятых из различных источников, или вместо железопорфиринового комплекса взять при этом порфириновый комплекс другого металла (разд. 7.1 и 7.4). Исследование мутантных форм и химически модифицированных гемоглобйнов существенно расширило наши знания о природе реакций гемоглобина, и в последующих разделах мы часто будем использовать результаты, полученные с помощью мутантных и модифицированных белков. [c.148]

Действительное количество разрушенного энзима часто не зависит от концентрации в широком диапазоне, а зависит только от количества энергии, поглощенной раствором. Это было показано на примере карбоксипептидазы, полифенолоксидазы и дезоксирибонуклеазы [В6, 02] (рис. 31) и явилось одним из наблюдений, приведших к признанию важности непрямого действия на вещества, представляющие интерес для биологии. Уменьшение выхода при очень низких концентрациях первоначально приписывалось реакции свободных радикалов друг с другом, но это приводило бы к зависимости выхода инактивации от мощности дозы, что большей частью не обнаруживается. Более правдоподобное объяснение заключается в том, что в случае очень малой концентрации энзима свободные радикалы реагируют преимущественно с примесями, имеющимися в воде. Количество инактивированного пепсина медленно увеличивается с концентрацией в том диапазоне, в котором инактивация карбоксипептидазы постоянна, т. е. при количестве белка выше 0,2 мг1мл [В54]. Ниже этого диапазона, как и для карбоксипептидазы, выход [c.259]

Селективное действие ионообменников явилось причиной возникновения новых направлений и в биологии. Здесь широко используются свойства доноров и акцепторов электронов. Груб-хофером и Шлейтом была получена синтетическая смола для разделения рацематов, в которую были введены оптически-активные группы следующим образом. Карбоксильная смола (амберлит ХЕ-64) была сначала переведена обработкой пири-динтионилхлоридом в хлорангидрид, который затем обработкой вторичным гидроксилом хинина был переведен в оптически-активный анионообменник. Первые фракции фильтрата, полученные при пропускании рацемического раствора молочной кислоты через колонку с таким обменником, содержали практически чистую 1-молочную кислоту. Названным авторам удалось далее посредством диазотирования аминосмолы, содержащей первичные ароматические аминогруппы, зафиксировать поглощение ионообменником ферментов, таких, как диастаза, пепсин, рибо-нуклеаза, карбоксипептидаза. Ферментная активность в процессе этой операции сохранилась. Интересны далее опыты Лауча и сотрудников , которые на этой основе построили искусственные модели ферментов. [c.433]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология