Коэффициент из зонального центрифугирования

Вирионы рабдовирусов имеют весьма характерную структуру в препаратах, окрашенных методом негативного контрастирования, обнаруживаются частицы вариабельной длины, имеющие закругленный и уплощенный концы (так называемые пулевидные частицы). Нормальные инфекционные вирионы имеют длину 170—180 нм и диаметр 70 нм. Дефектные интерферирующие частицы (ДИЧ) сохраняют характерную для инфекционных частиц пулевидную форму, но имеют меньшую длину. Они неинфекционны и накапливаются в возрастающем количестве при пассировании большинства типичных рабдовирусов без разведения благодаря их способности успешно конкурировать (интерферировать) с нормальными инфекционными частицами. ДИЧ имеют такой же химический состав, как и стандартные вирионы, но их геномная РНК имеет меньший размер. ДИЧ и стандартные вирионы данного вируса существенно различаются по коэффициентам седиментации, что используется для их разделения методом зонального центрифугирования. Метод, описанный ниже, эффективен для очистки вируса из культуральной среды. Хотя рабдовирусы высвобождаются из зара- [c.123]

Определение коэффициента седиментации с помощью зонального центрифугирования в предварительно приготовленном градиенте плотности [c.311]

Трение влияние формы 299 Молекулярная масса 300 Метод точного измерения коэффициента седиментации 301 Примеры использования скоростной седиментации 302 Зональное центрифугирование в предварительно подготовлен ном градиенте плотности 306 Определение коэффициента седиментации с помощью зонального центрифугирования в предварительно приготовленном градиенте плотности ЗП [c.578]

Зональный градиент плотности. Суть метода состоит в разделении смеси веществ в соответствии с их седимента-ционными коэффициентами с помощью центрифугирования в сахарозном градиенте в горизонтальном баке т-роторе, При этом вещества с различным молекулярным весом седиментируют в сахарозном градиенте с разной скоростью и проходят различные расстояния от мениска. [c.176]

При описанном выше ультрацентрифугировании пики, наблюдаемые при помощи шлирен-системы, отвечают границам между раствором и растворителем. Первые, быстрые пики отвечают компонентам, движущимся в окружении более медленных компонентов (фиг. 8). В биохимических смесях некоторые из этих медленных компонентов (например, рибосомы при анализе бактериального экстракта) создают большую вязкость. Измеряемые коэффициенты седиментации могут при этом очень сильно отличаться от приведенного к стандартным условиям значения Поэтому полученные при помощи скоростной седиментации значения s не всегда можно непосредственно использовать при планировании и анализе данных препаративного зонального центрифугирования в градиентах плотности. При зональном ультрацентрифугировании анализируемая смесь наносится в виде слоя на раствор с увеличивающейся по направлению ко дну плотностью (что предотвращает конвекционное перемешивание) и различные компоненты седиментируют в градиенте плотности в виде отдельных зон. Для наслоения смеси можно использовать специальную аналитическую ячейку, в которой техника наслоения принципиально не отличается от обычного препаративного наслоения на градиент. Одна из таких ячеек (Be kman Instruments In .) приведена на фиг. 15. Преимущества применения такой ячейки, как отмечают Виноград и Брунер [11], состоят в том, что она требует меньше исследуемого материала, анализируемые компоненты в ней пространственно разобщены, медленные примеси отстают от быстрее движущихся зон и седиментацию последних можно осуществлять в любом растворителе, не прибегая к предварительному диализу. Растворитель должен быть более плотным по сравнению с [c.67]

Точно так же, как для оценки времени осаждения в ультрацентрифуге компонента с данным ко фициентом седиментации s используются параметры ST, Pi или k, можно предложить аналогичный параметр к для зонального центрифугирования в градиенте плотности. В табл. 7 (данные фирмы Be kman Instruments In .) приведены значения этого параметра для различных роторов, выпускаемых этой фирмой. С помощью фактора к можно определить время, необходимое для седиментации частиц с данным коэффициентом седиментации и данной плотностью в градиенте плотности от мениска до дна пробирки. В таблице приведены девять значений этого фактора для различных роторов и для частиц с плотностями от 1,1 до 1,9 г/мл, седиментирующих в линейном градиенте сахарозы (5—20% по массе) при 5°С. [c.198]

Для выделения различных мембранных структур из гомогената, имеющих разные величины коэффициента седиментации, применяют зональное центрифугирование в градиенте плотности определенных веществ. Исследуемый раствор наносят на предварительно приготовленный в центрифужной пробирке градиент плотности и центрифугируют. Градиент создается путем последовательного наслоения растворов градиентной среды уменьшающейся концентрации (плотности) в центрифужной пробирке. Субклеточные структуры разделяются на отдельные зоны в соответствии с их относительной плотностью. Для создания градиента плотности необходимо подбирать вещества в чистом состоянии, не взаимодействующие с компонентами суспензии и реагентами исследуемого раствора. Чаще всего для этого используют сахарозу, однако ее растворы с высокой концентарцией имеют большую вязкость, вследствие чего происходит дегидратация органелл или их лизис. Кроме того, серьезным недостатком этого метода является проницаемость многих органелл для сахарозы, что вызывает их осмотическое разрушение и изменение эффективной плотности. Поэтому в настоящее время для создания градиента плотности предпочитают применять другие среды фиколл, перколл и др. (табл. 16). [c.218]

Кольцевую ДНК другого рода впервые обнаружили у бактериофага X. При исследовании ДНК фага X на ультрацентрифуге оказалось, что она представлена набором компонентов с различными коэффициентами седиментации. Если вьщелить один из компонентов при помоши зонального центрифугирования и оставить его в покое на некоторое время, он медленно перейдет в равновесную смесь компонентов. Использование ферментов, а также исследования с помощью электронного микроскопа показали, что два наиболее медленно седиментирующие компонента, 21S- и 245-компоненты, представляют собой соответственно двухцепочечную линейную и двухцепочечную кольцевую формы молекулы. Более быстрые компоненты являются /i-мерами этих последних, например линейными или кольцевыми лвухцепочечными молекулами двойной длины. Чтобы объяснить способность ДНК фага X претерпевать все эти взаимные превращения, было высказано [c.383]

Принцип метода зонального центрифугирования показан на рис. 11-22. Небольшой объем раствора, содержащего молекулы, которые следует охарактеризовать, наносят в виде слоя на раствор предварительно приготовленного градиента концентрации, находящегося в центрифужной пробирке. Наносимый раствор всегда имеет плотность, меньшую, чем плотность верхнего слоя градиента (в противном случае он будет погружаться в градиент). Затем пробирку центрифугируют, при этом молекулы исходного слоя седиментируют через градиент. Если все молекулы ймеют одинаковый коэффициент седиментации, то они будут седиментировать в виде узкой зоны, как показано на рис. 11-23. Если же в образце присутствуют молекулы с различными коэффициентами седиментации, то в ходе седиментации они будут разделяться. Различные компоненты будут разрешаться в виде серии зон или полос, которые затем седиментируют только через растворитель отдельно одна от другой. После окончания центрифугирования содержимое пробирки фракционируют, чаще всего собирая фракции по каплям через отверстие в дне пробирки [c.308]

Материал, полученный одним из описанных выше методов, обычно контаминирован клеточными компонентами. Однако в тех случаях, когда высокая степень очистки не обязательна (например, для постановки RIA или ELISA), его можно использовать уже на этой стадии. Тем не менее для большинства исследований необходима дальнейшая очистка вируса с помощью зонально-скоростного или изопикнического центрифугирования в градиенте. При скоростном центрифугировании положение вируса в градиенте определяется его коэффициентом седиментации, а при изопикническом — плавучей плотностью. Для достижения максимальной степени очистки вирусных частиц от примесей изменение концентрации образующего градиент вещества должно быть плавным в то же время на промежуточных стадиях очистки нередко используют ступенчатые градиенты. В некоторых случаях принципы скоростного и изопикнического центрифугирования совмещаются примером может служить использование градиентов глицерина — тартрата калия [14]. В таких градиентах концентрация тартрата калия возрастает в направлении дна пробирки, достигая плотности, соответствующей плавучей плотности вируса концентрация глицерина, наоборот, максимальна на мениске, что препятствует продвижению медленно седиментирующего материала в направлении дна. Все типы градиентов обычно центрифугируют в бакет-роторах, но в случае изопикнических градиентов такие же или даже лучшие результаты можно получить в угловых или вертикальных роторах с помощью приспособлений для медленного разгона и остановки, обеспечивающих переориентацию градиента без перемешивания. При очистке конкретного вируса часто приходится проводить целую серию последовательных стадий центрифугирования в разных типах градиентов, чтобы добиться нужной степени очистки. [c.100]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология