Максаму — Гилберту

Рис. 6. Схема определения 13-членной нуклеотидной последовательности в 30-членном фрагменте ДНК по Максаму — Гилберту

ДНК-полимеразной реакции (рассуатриваемой в гл. II при обсуждении репликации ДНК). Принцип метода показан иа рис. 7. Как и при секвенировании ДНК по Максаму — Гилберту, здесь добиваются, чтобы обрыв цепи (при попадании на ее З -конец комплементарного терминаторного нуклеотидного остатка) происходил равновероятно по всем положениям данного остатка (рис. 7 — остаток Т). Это достигается экспериментальным выбором правиль ного соотношения дезоксинуклеозидтрифосфатов и терминаторного [c.18]

Меченые фрагменты разделяют так же, как и при секвенировании ДНК по Максаму — Гилберту. [c.19]

В настоящее время существует множество вариантов как метода Максама — Гилберта, так и метода Сэнгера. Главное, эти методы удалось полностью автоматизировать. Так, например, при секвенировании ДНК по Сэнгеру на 5 -конец праймера вводят флуоресцентные метки, причем для каждого из четырех анализируемых нуклеотидов используются флуоресцирующие агенты с различными спектральными характеристиками. После электрофоретического разделения гель сканируется при четырех различных длинах волн и полученная информация сразу обрабатывается на ЭВМ. При этом все биохимические операции также проводятся роботом. [c.19]

Макропористые ионообменные смолы 2/1267, 304, 320, 701, 702, 1268 1/289, 311 Макрорадикалы 2/1268, 230, 231, 432 Макросетчатые смолы 2/1268 Макроскопическая константа скорости реакций 1/347 Макроуцобрения 3/54 Макроэлементы 5/34 Макроэргическне соединения 3/933 Максама-Гилберта метод 3/388, 389, [c.642]

Приходится удовлетвориться продуктом транскрипции — кДНК. Его можно продуцировать в больших количествах при росте клона и секвенировать по методу Максама — Гилберта или по методу Сенгера. Из нуклеотидной последовательности можно вывести аминокислотную последовательность. Конечно, первичная структура искомого белка, полученная таким путем, [c.370]

Почти одновременно было предложено два метода, основанных на одной принципиальной идеологии, хотя резко отличаюпц1хся по своему химическому содержанию. Эти методы известны как метод Максама - Гилберта и метод Сэнгера. [c.278]

Первый этап метода Максама — Гилберта сЬстоит в том, что в 5 -конец анализируемого полинуклеотида с помош ью полинуклеотид киназы вводят меченый остаток фосфорной кислоты максимально доступной удельной ак- [c.278]

Метод расщепления, используемый при секвенировании по Максаму — Гилберту, основан на реакции расщепления полидезоксирибонуклеотидной цепи по остаткам, лишенным гетероцикла, т.е. по апуриновым или апиримидивовым фрагментам. Это расщепление проходит в присутствии оснований по схеме [c.279]

Реакция проходит как по остаткам цитозина, так и по остаткам тимина. Однако в щелочной среде (0,1М КОН в гидразингидрате) реакция по дезокситимидиновым фрагментам подавляется и модификация проходит только по остаткам дезокси-цитидина. Это позволяет получить картину распределения остатков обоих пиримидиновых нуклеотидов и отдельно — дезоксицитидиновых звеньев. Этой информации достаточно, чтобы определить положение раздельно по каждому из пиримидиновых нуклеотидов. На рис. 78 приведены радиоавтограф геля, полученного методом Максама — Гилберта, и прочитываемая по этому гелю последовательность секвенированного полинуклеотида. [c.280]

Практически параллельно с методом Максама — Гилберта был развит другой метод секвенирования ДНК, получивший по имени создавшего его автора название метод Сэнгера. Этот метод считается наиболее перспективным для исследования первичной структуры больших молекул нуклеиновых кислот, вплоть до ДНК хромосом человека. В бго основе лежит анализ структуры не самой нуклеиновой кислоты, а продукта, получаемого в ходе ее репликации с помощью ДНК- юлимеразы. Аналогично, используя обратную транскрипцию, с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы можно анализировать структуру молекул РНК. [c.281]

Необходимо также добавление праймера (см. 5.1), комплементарного некоторому участку исследуемой матрицы. Структура участка должна быть заранее установлена, этого можно достигнуть, например, анализом последовательности нуклеотидов небольшого фрагмента исследуемой ДНК методом Максама — Гилберта. [c.281]

Метод неполных специфических химических расщеплений (метод Максама — Гилберта) используется для определения последовательности ДНК. Меченые концевые продукты получают путем специфического расщепления полинуклеотида химическими реагентами по одному из звеньев. Обработка проводится в услоанях неполной статистиче- [c.321]

Проблемой, которую каждый раз приходится решать при использовании метода Максама — Гилберта, является получение полинуклеотидов, меченных только по одному из концов. Обычно для анализа используются двухцепочечные фрагменты ДНК (например, образовавшиеся после расщепления рестриктазами), а все методы введения концевых меток приводят к образованию фрагментоа, меченных по двум 5 - нлн двум 3 -концам. Поэтому приходится прибегать к дополнительным операциям, таким, как разделение комплементарных цепей ДНК после введения метки. [c.325]

Метод Сенгера наиболее часто используется для анализа последовательности ДНК после ее неспецифического расщепления и клонирования суммы получаемых фрагментов. Метод весьма эффективен и экономичен, так же как метод Максама — Гилберта, и позволяет анализировать последовательность свыше 200 звеньев на одном геле. [c.328]

В щелочных условиях реакции с гидразином и гидроксиламииом приводят к расщеплению гетероциклическ11Х колец пиримидинов (см. с. 325), практически не затрагивая пуриновых оснований. Реакция ДНК с гидразином, сопровождающаяся расщеплением по пиримидиновым звеньям, используется при определении нуклеотидной последовательности ДНК в методе Максама — Гилберта. [c.386]

Реакция с 0з04 может использоваться для установления положения тимидиновых звеньев при определении первичной структуры ДНК методом Максама — Гилберта. [c.387]

Рис. 16. Метод Свердлова — Максама — Гилберта (схема).

Дополнение 27-1. Секвенирование короткого фрагмента ДНК при помопщ химического метода Максама-Гилберта [c.887]

С помощью этого метода за короткий срок удалось установить полную нуклеотидную последовательность ДНК SV 40, рекомбинантной плазмиды pBR322 и многих других последовательностей ДНК. Однако секвенирование методом Максама-Гилберта имеет ряд недостатков, связанных с длительностью и значительной трудоемкостью процедур. В настоящее время на основе секвенирования с помощью химической деградации разработаны усовершенствованные и быстрые методы определения нуклеотидной последовательности, в том числе твердофазное секвенирование и секвенирование с использованием обращенно-фазовой хроматографии. [c.30]

Рис. 9.9. Радиоавтограф электрофоретического геля, по которому считывают нуклеотидную последовательность методом Максама - Гилберта. Изображена последовательность нуклеотидов, заключенная между двумя генами а-гло-бина ДНК человека. Фрагмент ДНК был помечен на З -конце и обработан рестриктазами, расщепляющими по О, С, О и А и С и Т (для определения нуклеотидной последовательности нет необходимости в том, чтобы расщепление цепи происходило по единственному основанию). Слева представлена последовательность, которую можно считать с геля.

Рис. 14.15. Локализация сайтов связывания интегразы фага X с участком POP с помощью метода футпринтинга . Аликвоты, содержащие рестрикционный фрагмент, 5 -конец одной из цепей которого помечен Р, подвергали частичному расщеплению неокарциностатипом (расщепляет по А и Т) в присутствии и в отсутствие интегразы или гепарина. Набор образующихся фраг-МЬнтов анализировали с помощью гель-электрофореза (три левые дорожки). В двух правых дорожках — фрагменты, образующиеся при расщеплении того же меченого фрагмента по пуриновым или по пиримидиновым нуклеотидам методом Максама — Гилберта, для идентификации участков последовательности, защищаемых интегразой. (По Hsu Р. L,

МО иметь большое количество идентичных молекул ДНК. Наработку интересующей последовательности можно осушествить клонированием соответствующего фрагмента. Проиллюстрированный на рис. 36.6 метод секвенирования по Максаму-Гилберту основан на химическом расщеплении ДНК по определенному основанию. Другой ферментативный метод—метод Сэнгера—базируется на применении аналогов нуклеотидов, прерывающих синтез комплементарной цепи ДНК по одноцепочечной матрице в месте встраивания в цепь соответствующего аналога. [c.44]

Простота, с которой можно получить четкие надежные данные, не прибегая к клонированию в бактериях, определяется 1) способностью ПЦР-затравок амплифицировать только интересующие последовательности (специфичность праймера) и 2) способом получения образца, приемлемого для секвенирования. Для прямого секвенирования продуктов ПЦР вполне пригоден химический метод (Максама — Гилберта). Мы рассмотрим здесь только наиболее распространенный метод Сэнгера, использующий нуклеотиды-терминаторы полимеразной реакции. Специфичность ПЦР-затравок в принципе определяет гомогенность амплифицируемых последовательностей. В идеале, в результате реакции экспоненциально наращивается только интересующая последовательность. Однако в реальных условиях многие праймеры амплифицируют также различные посторонние последовательности. Повышая температуру отжига в полимеразной реакции, это осложнение удается преодолеть [12]. К тому же для устранения затруднений, связанных со свойствами конкретной амплифицируемой последовательности, можно применить предварительную очистку интересующей последовательности электрофорезом в геле или использовать денатурирующий градиентный гель [15]. [c.185]

Секвенирование олигонуклеотидов по методу Максама — Гилберта. [c.284]

При помощи метода Максама — Гилберта можно секвениро-вать как однонитевую, так и двунитевую ДНК, так как меченный с одного конца двунитевой фрагмент ДНК несет метку только с 5 -конца одной нити ДНК. Стратегия секвенирования длинных (> 1000 п. н.) фрагментов ДНК состоит в следующем [c.285]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология