Секвенирование олигонуклеотидов

Олигонуклеотиды, синтезированные химическими методами, находят широкое применение в молекулярной биотехнологии. Их используют в качестве зондов при ДНК-гибридизации, линкеров, соединяющих разные молекулы ДНК в экспериментах по клонированию, праймеров при секвенировании ДНК или осуществлении сайт-специфического мутагенеза клонированных генов-мишеней. [c.85]

Одноцепочечные олигонуклеотиды из -17-24 звеньев используют в качестве праймеров при секвенировании ДНК и проведении ПЦР. [c.86]

Сразу вслед за разработкой быстрых методов секвенирования появились столь же быстрые и простые методы синтеза сравнительно длинных олигонуклеотидов с определенной, заранее заданной последовательностью. Теперь довольно легко можно синтезировать последовательность до 100 нуклеотидов. Автоматизация этой процедуры еще более облегчает и ускоряет синтез. [c.33]

Синтетические олигонуклеотиды используются в качестве линкеров или адаптеров для облегчения встраивания ДНК в векторы, затравок для ферментативного синтеза ДНК, а также затравок при секвенировании ДНК и РНК. Их применяют для сайт-направленного мутагенеза и как контрольные элементы для изучения экспрессии генов. Синтетические нуклеотиды используют также для конструирования полных генов. В зависимости от цели использования их длина варьирует от 5 до 60 нуклеотидов. Трудности, возникающие при получении длинных олигонуклеотидов, связаны не с собственно их синтезом, а с очисткой материала. [c.88]

Ввиду только что отмеченного обстоятельства разделение коротких олигонуклеотидов строго по их длине предпочитают вести в гелях, где фиксация однонитевого состояния нитей ДНК или РНК обеспечивается не щелочью, а присутствием высокой концентрации мочевины. Образуя прочные водородные связи с нуклеиновыми основаниями, мочевина препятствует их комплементарному спариванию. Сама по себе мочевина не распрямляет нити полинуклеотидов, но в отсутствие нейтрализации фосфатов ионами металлов эти нити оказываются достаточно расправленными для того, чтобы обеспечить надежное разделение олигонуклеотидов длиной в несколько сотен мономерных звеньев, отличающихся между собой всего лишь на одно звено. Именно такая задача стоит при использовании электрофореза в современных методах определения последовательности оснований ( секвенирования ) в молекулах ДНК и РНК. [c.131]

Секвенирование олигонуклеотидов по методу Максама — Гилберта. [c.284]

Для секвенирования ДНК по методу Сэнгера ее клонируют в однонитевых фагах. Основа метода Сэнгера — синтез радиоактивных копий однонитевой ДНК от фиксированного олигонуклеотида-затравки в присутствии нуклеотидспецифичных терминаторов синтеза ДНК. Чтобы облегчить выделение однонитевых матриц, Дж. Мессингом сконструирована серия векторов на основе фага М13, содержащего в капсидах однонитевую ДНК. Биология размножения М13 чрезвычайно удобна для создания таких векторов. М13 реплицируется в клетке в виде двунитевой репликативной формы, которую можно легко выделить и использовать для клонирования чужеродной ДНК как обычную плазмидную ДНК. В то же время такие рекомбинантные клоны выделяют и из суспензии зрелых частиц фага в однонитевой форме. Сконструированные Мессингом векторы содержат полилинкер, т. е. последовательность, являющуюся мишенью для нескольких рестриктаз, для клонирования ДНК в области фагового генома несущественной для его размножения кроме того, при вставках чужеродной ДНК изменяется цвет фаговых негативных колоний (пятен лизиса на газоне бактериальной культуры) на среде с индикаторным красителем. Для секвенирования олигонуклеотид- [c.285]

Идентификация модифицированных нуклеотидных остатков в полинуклеотидной цепи РНК долгое время была задачей особой трудности. С появлением современных методов секвенирования нуклеиновых кислот она существенно упростилась. Модификацию РНК или ее расщепление ферментами ведут таким образом, чтобы (как и при секвенировании) было затронуто в среднем только одно звено на молекулу (в чем есть дополнительный смысл, так как множественная модификация РНК искажает ее структуру). Далее, если изучается РНК небольшого размера или сегмент РНК, примыкающий к одному из ее концов, то этот конец метят радиоактивной меткой и задача идентификации модифицированного основания (после расщепления соответствующего звена) или атакованной нуклеазой межнуклеотидной связи сводится, как и при секвенировании, к определению длины фрагмента по его подвижности в высокоразрешающем электрофорезе в геле. В том случае, когда анализируемый район удален от концов молекулы на расстояние больше 150—200 н. о., используют реакцию обратной транскрипции (см. гл. 13). Для этого синтезируют олигонуклеотид, комплементарный участку РНК, расположенному вблизи от анализируемого района с З -концевой стороны молекулы, и далее используют его как праймер для обратной траискриптазы. Так как этот фермент останавливается на модифицйрованных остатках матрицы (или в том месте, где расщеплена фосфодиэфирная связь), то вновь по длине образующегося фрагмента можно определить положение модифицированного звена в РНК. [c.40]

Фракционирование олигонуклеотидов в тонком слое играет центральную роль в некоторых методах секвенирования нуклепновых кислот, особенно тРНК, где из-за высокого уровня содержания модифицированных нуклеотидов методы секвенирования с использованием электрофореза в ПААГ наталкиваются на серьезные трудности. [c.496]

К описанным модификациям метода двумерного фракционирования олигонуклеотидов, ведущего свое происхождение от метода Сэнджера, мы снова вернемся в конце раздела при сопоставлении методов секвенирования тРНК, а сейчас остановимся на совершенно другом варианте двумерного фракционпрования олигонуклеотидов — с помощью ТСХ в обоих направлениях, т. е. без использования электрофореза. [c.500]

Далее проводили фосфорилирование всех олигонуклеотидов по 5 -концам радиоактивным фосфором за счет [7- PlATP с помощью Т4-полинуклеотидкпназы. Смесь меченых олигонуклеотидов разделяли электрофорезом в ПААГ, получая лестницу полос, как было описано при рассмотрении электрофореза [Остерман, 1981]. В отличие от методов секвенирования ДНК здесь каждой полоске ( перекладине лестницы ) соответствует фрагмент, укороченный точно на один нуклеотид по сравнению с фрагментом предыдущей полоски. Как и при секвенировании ДНК, меченые гидролизаты наносили в параллельные треки со сдвигом по времени в 4, 8 и И ч, а весь электрофорез проводили в течение 14 ч, с тем чтобы лучше разрешить разные по длине фрагментов участки лестницы . [c.508]

Метод ПЦР применяется также для выявления спонтанных мутаций, внесения специфических мутаций in vitro, сборки полноразмерных генов из синтетических олигонуклеотидов, секвенирования ДНК. Во многих случаях возникает необходимость в клонировании ПЦР-продук-та. Однако прямое клонирование с помощью лигирования по тупым концам затруднено, по- [c.97]

Если при амплификации геномной ДНК позвоночных в качестве праймеров для ПЦР используют олигонуклеотиды длиной 20 нуклеотидов и более, то процесс этот довольно специфичен и амплифицируется только один фрагмент ДНК- Однако иногда среди продуктов реакции наблюдается накопление фрагментов, происхождение которых трудно объяснить. А поскольку эти фрагменты могут мешать последующему анализу (РНКазному расщеплению, ДГГЭ, секвенированию), то рекомендуется провести еще одну серию амплификаций, с использованием другого набора олигонуклеотидных праймеров. Этот метод, именуемый nested oligo [22], состоит в следующем продукт первичной полимеразной цепной реакции используется в качестве матрицы в последующих раундах ПЦР, но уже с двумя другими олигонуклеотидами, имеющими гомологии с участками ДНК внутри первичного амплифицированного фрагмента (рис. 6, Б). Такая процедура позволяет получить большое количество индивидуальной последовательности ДНК, несколько более короткой, чем исходный фрагмент, и использовать ее для последующего анализа. [c.139]

Рис. 11.15. Исходная структура однонитевого вектора М13 со вставкой клонированной ДНК и олигонуклеотидом-затравкой, испоЛьзуемая при секвенировании по методу Сэнгера (А). Пунктирная стрелка указывает направление последующего синтеза комплементарной нити. Продукты элонгации затравки в присутствии ddATP, останавливающего рост синтезируемой нити в точках, соответствующих А-аденину (Б)

Прежде чем перейти к описанию получения двуцепочечных фрагментов ДНК, несущих единственную метку на одном из концов, все же необходимо упомянуть о Других одноцепочечных фрагментах ДНК, синтезируемых химическим путем, - олигонуклеотидах, точность синтеза которых иногда проверяют секвенированием. Следует отметить, что после мечения 5 -конца синтезированного одноцепочечного олигонуклеотида с помощью полинуклеотидкиназы (причем предварительное дефосфорилирование в данном случае не требуется, так как в результате синтеза 5 -конец олигонуклеотида не несет остатка фосфорной кислоты) образуется сразу пригодный для секвенирования фрагмент ДНК с меткой на одном конце. [c.25]

Даже самый малый (обычный) масштаб синтеза олигонуклеотидов в 0,05 мкмоль (существуют синтезаторы с масштабом синтеза и 0,03 мкмоль) позволяет синтезировать в тысячи раз превышающее количество олигонуклеотидов, используемых в качестве затравки в реакциях секвенирования. Остаток праймера, как правило, больше нигде не применяется, что крайне неэкономно. Данное обстоятельство заставляло искать какие-то новые варианты стратегии секвенирования ДНК праймерной прогулкой . [c.65]

Рис. 2.16. Схема использования октамерных олигонуклеотидов в качестве уникальных праймеров для секвенирования ДНК праймерной прогулкой при помощи дифференциального удлинения данного праймера неполным набором дезоксинуклеотидтрифосфатов

Многие приборы позволяют осуществлять различный масштаб синтеза олигонуклеотидов, варьирующий обычно от 0,05 до 5 или даже 10 мкмоль. Крупные масштабы синтеза применяются при синтезе праймеров для диагностических целей. Для секвенирования же ДНК масштаб синтеза в 0,05 мкмоль часто оказывается избыточным. В связи с этим был разработан мультиплексный ДНК-синтезатор, позволяющий в автоматическом режиме осуществлять одновременный синтез 96 независимых образцов в полипропиленовом микропланшете с масштабом синтеза всего 0,02 мкмоль или 20 нмоль, что позволило резко снизить стоимость получаемых олигонуклеотидов [Lashkari et al., 1995]. Одновременный синтез 10 независимых образцов позволяет производить EMBL ДНК-синтезатор, характеризующийся к тому же экономным расходованием реактивов [Ansorge et al., 1996]. [c.77]

Видимо, здесь, в этом разделе, будет целесообразным упомянуть об относительно недорогом отечественном синтезаторе ДНК ASM-102U, выпускаемым ТОО БИОССЕТ (Новосибирск), который вполне способен обеспечить олигонуклеотидными праймерами для секвенирования ДНК и проведения ПЦР любую лабораторию. Однако в настоящее время весьма развит так называемый заказной синтез олигонуклеотидов, включая синтез модифицированных олигонуклеотидных праймеров, несущих какие-либо функциональные группы, что является дешевой альтернативой собственному синтезатору ДНК. Более подробную информацию о синтезаторе ДНК ASM-102U, а также о фирмах, занятых в заказном синтезе олигонуклеотидов, заинтересованный читатель может найти в разделе Отечественные поставщики материалов и оборудования для секвенирования ДНК. [c.77]

Смотреть страницы где упоминается термин Секвенирование олигонуклеотидов: [c.77] [c.73] [c.20] [c.499] [c.499] [c.505] [c.20] [c.89] [c.90] [c.282] [c.105] [c.445] [c.105] [c.17] [c.19] [c.38] [c.52] [c.59] [c.60] [c.62] [c.64] [c.70] [c.72] [c.74] [c.75] [c.76] [c.78]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология