Электрофорез последовательный

Последние годы ознаменовались огромными успехами в изучении строения и функций важнейших биологически активных полимеров. Благодаря развитию новых методов разделения н очистки веществ (различные методы хроматографии, электрофореза, фракционирования с использованием молекулярных сит) и дальнейшему развитию методов рентгеноструктурного анализа и других физико-химических методов исследования органических соединений стало возможным определение строения сложнейших природных высокомолекулярных соединений. Изучено строение ряда белков (работы Фишера, Сейджера, Стейна и Мура). Установлен принцип строения нуклеиновых кислот (работы Левина, Тодда, Чаргаффа, Дотти, Уотсона, Крика, Белозерского) и экспериментально доказана их определяющая роль в синтезе белка и передаче наследственных признаков организма. Определена последовательность нуклеотидов для нескольких рибонуклеиновых кислот. Широкое развитие получили работы по изучению строения смешанных биополимеров, содержащих одновременно полисахаридную и белковую или липидную части и выполняющих очень ответственные функции в организме. [c.53]

С-Концы пептидных цепей определяются избирательным отщепле нием концевой аминокислоты с помощью специфического фермента — карбоксипептидазы и последующей идентификацией этой аминокислоты. Если макромолекула белка состоит из двух (или более) пептидных цепей, как в случае инсулина (см. рис. 53), то избирательно разрушают дисульфидные мостики окислением (например, надмуравьиной кислотой) и затем полученные полипептиды разделяют путем фракционирования на ионитах. Для определения последовательности расположения аминокислот в каждой полипептидной цепи ее подвергают частичному кислотному гидролизу и избирательному расщеплению с помощью ферментов, каждый из которых разрывает полипептидную цепь только в определенных местах присоединения какой-то одной определенной аминокислоты или одного типа аминокислот (основных, ароматических). Таким образом получают несколько наборов пептидов, которые разделяют, используя методы хроматографии и электрофореза. [c.376]

Расщепление нуклеиновых кислот под влклнием специфических ферментов — эндо- и экзонуклеаз — сопровождается разрывом фосфо-диэфирной связи и образованием продуктов различной величины, которые могут быть разделены методами электрофореза и хроматографии. Это широко используется при анализе последовательности нуклеотидов в молекулах РНК и ДНК., Особое значение при развитии генной инженерии получило расщепление ДНК специфическими эндонуклеазами (рестриктазами), позволяющее получать отрезки ДНК определенной длины и нуклеотидного состава. > [c.175]

ДНК-зонды применяют для поиска родственных генов в реакциях гибридизацрш с РНК — для выявления экспрессии данного гена в различных клетках. Для вьывления молекул нуклеиновых кислот, комплементарных всему зонду (или его участку), ДНК-зонды часто сочетают с методом гель-электрофореза, что позволяет получать информацию о размерах гибридизируемых молекул ДНК. Эффективное использование современных приборов, способных автоматически синтезировать любые нуклеотидные последовательности за короткий промежуток времени, дало возможность перестраивать гены, что представляет собой один из важных аспектов генной инженерии. Обмен генами, а также введение в клетку гена другого вида организма осуществляют посредством генетической рекомбинации in vitro. Этот подход был разработан на бактериях, в частности на Е. соИ. Он основан на важном свойстве ДНК — способности к перестройкам, изменяющим комбинацию генов в геноме и их экспрессию. Такая уникальная способность ДНК позволяет приспосабливаться данному виду к изменяющейся среде. Генетическую рекомбинацию подразделяют на два больших класса общую рекомбинацию и сайт-специфическую рекомбинацию. В процессе общей рекомбинации генетический обмен в ДНК происходит между гомологичными нуклеотидными последовательностями, например между двумя копиями одной и той же хромосомы в процессе мейоза (кроссинговера), или при скрещивании и перегруппировке генов у бактерий. [c.112]

Двумерный электрофорез. Данный метод более трудоемкий, требует двух последовательных электрофорезов. [c.40]

Ларсон и соавторы в аналитических опытах на микроколонке (0,15 X 10 см) исследовали оптимальные условия для фракционирования рестриктов ДНК в системе ХОФ-5 при среднем давлении ( 33 атм) и скорости элюции 13 мл/ч. Наилучшее разделение 17 фрагментов размерами от 43 до 850 пар оснований получалось у них при использовании очень пологого линейного градиента (0,55—0,75 М K I) объемом 40 мл (220 Fj) в нейтральном буфере при температуре 43°. Повышение температуры, по их данным, затрудняет элюцию ДНК и растягивает ее профиль. Удается разделить фрагменты длиной 98 и 102 пары оснований, чего далеко не всегда можно добиться с помощью электрофореза. Длина липких концов рестриктов и их состав влияют на разделение, равно как и нуклеотидный состав ДНК и даже последовательность оснований. Подчеркивается нео - [c.173]

В период между 1925 — 1930 гг. Сведберг с помощью ультрацентрифугирования произвел определение молекулярных масс различных белков. Одновременно применение других аналитических методов, как, например, электрофореза и различных видов хроматографии, привело к развитию аналитической белковой химии. В 1951 — 1956 гг. Сенгер [20, 21] установил аминокислотную последовательность инсулина. Использованные при этом методы легли в основу систематического определения первичной структуры многих белков. Созданный Эдманом в 1966 г. секвенатор и применение масс-спектрометрии в сочетании с ЭВМ как средством регистрации, обработки и оценки масс-спектрометрических данных привели к тому, что к настоящему времени опубликовано более 15 ООО работ, посвященных определению аминокислотных последовательностей, и установлены первичные структуры более чем для 1000 белков. [c.343]

Двумерное разделение пептидов, наиример гидролизатов белков, на целлюлозных н силикагелевых пластинках, где в одном (чаш е первом) направлении используется электрофорез в тонком слое (ТСЭ) при кислом pH буфера, а во втором — распределительная ТСХ. Оно применяется как для целей идентификации и сопоставления родственных белков (например, для выявления мутационных или патологических изменений), так и в качестве препаративного метода для последуюш,его анализа аминокислотной последовательности в пептидах. [c.460]

Необходимым компонентом системы сплайсинга гигантских ядерных предшественников мРНК являются так называемые малые ядерные РНК- Эти РНК обогащены уридином, поэтому они получили название U РНК U1, U2, U3, U4 и т. д. Они легко разделяются с помощью электрофореза. Разные малые ядерные РНК отличаютсл числом нуклеотидов, входящих в их состав (от 90 до 400). Обнаружена исключительная консервативность нуклеотидных последовательностей малых ядерных РНК птиц, млекопитающих и дрозофилы. [c.177]

Смесь пептидов, образующихся в результате использования различны> методов расщепления, сначала должна быть разделена, и каждый из пептидов очищен. Целевой компонент перед анализом последовательности должен быть гомогенен по данным как минимум четырех различных методов разделения ионообменной хроматографии, электрофореза, бумажной или тонкослойной хроматографии и противоточного распределения. [c.366]

Одну и ту же ДНК использовали в четырех независимых реакциях и затем реакционную смесь разделили в электрофорезе. Последовательность читают сразу по всем четырем дорожкам геля, переходя снизу вверх от полосы к полосе, как показано зигзагом. Положение О, А и С определяют по трем левым дорожкам. На правой дорожке находится сумма С и Т, поэтому разница третьей (С) и четвертой (С -I- Т) дорожек позволяет определить положение Т. Таким образом, последовательность ДНК, изображенную на рисунке, можно прочитать [c.50]

При одновременном проведении хроматографирования и электрофореза бумажный лист пропитывают раствором электролита и закрепляют между разноименными электродами. Одновременно с подачей напряжения на электроды от источника постоянного тока обеспечивают движение вдоль бумаги подвижного растворителя. Такой процесс значительно сокращает время разделения, однако выполнение его связано с некоторыми техническими трудностями. Поэтому целесообразнее проводить оба процесса последовательно. [c.119]

Рис. 32. Схема прибора для получения электрофоретических хроматограмм при последовательном проведении хроматографии и электрофореза

В тех случаях, когда электрофорез и хроматографирование необходимо проводить при различных значениях pH, их проводят последовательно 1[29]. [c.86]

В этой последовательности и будут разобраны конкретные примеры, но сначала следует рассмотреть имеющ ийся в продаже ассортимент носителей для ТСХ и тонкослойного электрофореза, новейшую аппаратуру и вкратце изложить технические аспекты постановки экспериментов. [c.460]

Обычно химическая процедура расщепления ДНК выполняется одновременно для четырех одинаковых проб ДНК с использованием химических агентов, расщепляющих ДНК по отдельным нуклеотидам (Т, С, G и А). Полученные образцы подвергают электрофорезу на параллельных дорожках одного геля, и по его результатам можно определить нуклеотидную последовательность ДНК (рис. 5.3). [c.109]

Сильный подъем в применении КЭ, особенно КГЭ, а также появление в продаже промышленных приборов связаны с американским проектом "Геном человека". С помощью метода КГЭ практически полностью были разделены молекулы ДНК в реакции определения последовательности нуклеотидов ДНК или остаточных фрагментов. Из применяемых типов гелей в классическом планарном гелевом электрофорезе в капиллярах в качестве матриц применяют в основном акриламид, агарозу и целлюлозу. Эти гели очень сильно различаются по своим физическим свойствам, таким как вязкость, стабильность в электрическом поле, пористая структура и размер пор. [c.96]

Ввиду того что установление последовательности аминокислот белков представляет трудоемкую и сложную задачу, усилия были направлены на совершенствование современной методики и технических средств. Речь идет о методе выявления термочувствительных аллелей, который позволяет обнаруживать в среднем вдвое большую изменчивость [89]. Это относится также к методу двумерного электрофореза. [c.61]

В середине 1960-х годов начались исследования нуклеотидных последовательностей РНК. Первыми были определены первичные структуры тРНК (Р. Холли и сотр., 1965 А. А. Баев и сотр., 1967). Развитие техники фракционирования фрагментов нуклеиновых кислот и прежде всего гель-электрофореза (Ф. Сэнгер и сотр.) позволило в начале 1970-х годов приступить к изучению первичной структуры высокомолекулярных РНК. В 1976—1978 гг. были созданы исключительно быстрые и эффективные методы секвени-рования ДНК и РНК (А. Максам и У. Гилберт, Ф. Сэнгер и сотр.), которые позволили за короткое время получить огромную информацию о первичной структуре генов, их регуляторных элементах, вирусных и рибосомных РНК и т. д. [c.7]

Фракционирование белков сыворотки крови на КМ-целлюлозе осуществляют с помощью ступенчатого элюирования, подавая на колонку последовательно следующие растворы 0,02 М натрий-ацетатный буфер, pH 4,6 ( стартовый буфер), затем 0,05 М натрий-ацетатный буфер, pH 5,2 0,08 М натрий-ацетатный буфер, pH 6,0 0,1 М фосфатный буфер, pH 7,0 и, наконец, 0,1 М фосфатный буфер, содержащий 0,5 М Na l, pH 8,3. Каждый новый раствор подают на колонку только после того, как полностью элюируется пик, вымываемый предыдущим раствором. Скорость тока приблизительно составляет 50 мл/ч. Элюат собирают порциями по 2—3 мл. Обработку результатов см. на с. 108. Идентификацию белков осуществляют методом электрофореза на бумаге или в полиакриламидном геле (с. 112). Регенерацию КМ-целлюлозы проводят вне колонки. [c.113]

Кроме того, выделен в чистом виде [94] 7-глиадин (глиадин 50), который по молекулярной массе явно превосходит все другие, обнаруженные ранее 7-глиадины. Таким образом, еще остается определенная неясность в отношении истинных молекулярных масс у разных 7-глиадинов, которая может очень отчетливо отражать гетерогенность 7-глиадинов, намного более сильную, чем та, что выявляет анализ с помощью электрофореза в кислой среде. Впрочем, выявлено существование, по крайней мере, 9 7-глиадинов [134], а некоторые исследователи на основе анализа N-концевых последовательностей полагают, что фракция, обозначаемая 72 в действительности, включает не менее двух главных и трех минорных белков и что фракция 73 также гете-рогенна [19]. По молекулярной массе ш-глиадины превосходят а-, Р- и 7-глиадины, но они также образованы одной — единственной полипептидной цепью. Совокупность результатов, полученных разными авторами, указывает на существование двух групп ш-глиадинов — с молекулярными массами соответственно около 65 000 и 75 000—80 000 (табл. 6Б.7). [c.191]

Все белки содержат пептидный скелет, но для каждого из них характерна своя последовательность боковых групп, которая и определяет его свойства. Если белки имеют различные соотношения числа кислых и основных боковых групп, то вследствие этого их изоэлектрические точки отличаются друг от друга. В растворе с заданной концентрацией ионов водорода некоторые белки движутся по направлению к катоду, а другие — по направлению к аноду в зависимости от величины заряда, а также от величины и размера молекулы различные белки движутся с неодинаковой скоростью. Подобное различие в поведении в электрическом поле лежит в основе одного из методов разделения и анализа белковых смесей — электрофореза [c.1055]

После определения последовательности в каждой цепи нужно было еще установить, какие полуцистиновые остатки связаны между собой. Санжер решил эту проблему (1955) частичным гидролизом инсулина в таких условиях, в которых связь S—S остается незатронутой. Образовавшиеся цистинпептиды, без отделения от других компонентов, фракционировали и окисляли до цистеиновых пептидов. Цистеино-вые пептиды каждой фракции отделяли электрофорезом и идентифицировали. Таким образом была выяснена полная структура этого белкового гормона (см. Схему ва стр. 699). [c.698]

Электрофорез на колонках. Колонку заполняют суспендированным в буфере носителем. Фракционируемую смесь отрицательно заряженных веществ (что имеет место для большинства биологических материалов) наносят в колонку сверху, а положительно заряженных — снизу. Сбор фракций после электрофореза осуществляют путем последовательного элюирования буферным раствором. [c.146]

Схема проведения опыта стеклянные трубки последовательно заполняют смесью реактивов, из которых вначале полимеризуется мелкопористый, а затем — крупнопористый гель, после чего трубки соединяют с электродными камерами, которые заполняют буферным раствором так, чтобы в него погрузились верхний и нижний концы трубок. Сверху под буфер в трубки вносят исследуемый образец. После электрофореза гель извлекают из трубок, фиксируют и определяют исследуемые вещества. [c.148]

Вновь синтезируемые цепи получают радиоактивно меченными за счет включения Фрагменты различной длины, синтез каждого из которых останавливается перед заданным основанием, получают лимитированием подачи этого основания. В результате протекания четырех параллельных синтезов, осуществляемых в условиях дефицита по А, С, G и Т, соответственно, происходят остановки перед различными основаниями (—А, —С, —G и —Т). Одновременный электрофорез этих четырех образцов дает последовательность полос на авторадиограмме, с которой можно непосредственно считать последовательность примерно 100—150 остатков. [c.189]

В результате гидролиза в разных условиях получается набор полипептидных осколков, которые разделяют хроматографическими методами, разработанными Мартином и Синджем. Это методы бумажной хроматографии, распределительной хроматографии, а также электрофореза. Последовательность связей аминокислот в каждом из полипептидных осколков может быть установлена нриведенпыми выше методами, например методом Эдмана. Сопоставляя эту последовательность в %<аждом осколке [c.699]

Введение дисперсной фазы в дисперсионную среду вызывает изменение ее электрических свойств — электропроводности и диэлектрической проницаемости, а также появление новых — электрокинети ческих эффектов электрофореза, а для сравнительно грубодисперсных систем, оседающих в поле силы тяжести (или центробежном поле), токов и потенциалов седиментации. Рассмотрим последовательно эти эффекты в дисперсных системах. [c.191]

Экзонуклеазы отщепляют нуклеотиды с концов полинуклеотидных цепочек, в то время как эндонуклеазы делают разрывы внутри цепи. Одни из них гидролизуют лишь одноцепочечные молекулы, другие— двухцепочечные. Некоторые нуклеазы разрывают обе цепи ДНК, тогда как другие надрезают молекулу, внося разрыв лишь в одну из цепей. Специфичность ряда нуклеаз отражена в табл. 2-11. Частичный ферментативный гидролиз РНК дает расщепление молекулы на короткие нуклеотидные последовательности, позволяющие далее определить полную последовательность РНК. (Первой РНК, для которой установлена последовательность, была аланиновая тРНК. Расщепление проводили с помощью панкреатической рибонуклеазы и рибонуклеазы Т1 [133]. Очень полезным методом получения нуклеотидных карт оказался двумерный электрофорез в полиакриламидном геле [134]. [c.168]

Сенжер и Коулсон создали метод анализа последовательности ДНК, который основан на ферментативном копировании однонитевых частиц ДНК [18]. Максам и Гилберт создали метод, в основу которого положена химическая модификация четырех оснований, входящих в состав ДНК, и который с одинаковым успехом применим как к однонитевым, так и к двунитевым молекулам ДНК [19]. Оба метода используют авторадиографическое определение згр-меченных олигонуклеотидов, которые разделяют в зависимости от их длины электрофорезом денатурированных фрагментов в полиакриламидном геле. На практике, успех этих методов во многом определяется недавними достижениями в энзимологии нуклеиновых кислот, особенно использованием ферментов рестрикции, расщепляющих молекулы ДНК, и обратной транскриптазы, с помощью которой получают циклические ДНК, комплиментарные РНК-матрице. Нижеследующее описание методики анализа будет, однако, предполагать наличие гомогенных образцов ДНК подходящей длины. [c.188]

Такую смесь меченых фрагментов олигонуклеотида снова подвергают двумерному фракционированию электрофорезом на ацетилцеллюлозе и гомохроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе, как описано выше, а затем проводят авторадиографию. Однако теперь вместо разбросанных по всей иластпнке иятен фингерприита получается зигзагообразная цепочка следующих друг за другом пятен (рис. 173), анализ расположения которых дает информацию о последовательности нуклеотпдов в олигонуклеотиде. [c.504]

В аналогичной работе [Pirtle et al., 1980] электрофорез в геле велп на длине 90 см, а полосы вырезали, элюировали порознь, переваривали РНКазами Т1 и Т2 в растворе, а затем наносили в той же последовательности на старт пластинки PEI-целлюлозы для идентификации 5 -концевых нуклеозиддифосфатов. [c.509]

Электрофорез ведут при напряжении 2000 в (при эффективной длине полоски около 40 см градиент напряжения составляет около 50 в/см) и силе тока 25 ма в течение 90 мин. Затем полоску вынимают, сушат на воздухе и разрезают вдоль на полоски шириной 5 см, соответствующие нанесенным углеводам, и каждую полоску на участки длиной 1 см. Участки нумеруют последовательно от анодного конца полоски к катодному. Из каждого участка вещество элюируют водой в тщательно вымытые пронумерованные градуированные пробирки и элюаты разбавляют водой до 1,5 мл. В каждую пробирку прибавляют по 3 мл сульфатированного а-нафтола (раствор 0,4 г а-нафтола в 100 мл концентрирован- ной серной кислоты выдерживают 8 ч при комнатной температуре). В процессе смешивания растворы охлаждают, а затем нагревают в течение 30 мин на кипящей водяной бане. После охлаждения определяют степень поглощения раствором Светового потока при 555 ммк. Затем строят график, отражающий изменение степени поглощения света в зависимости от расстояния от анода. Возникающие пики На графике указывают положение зон полисахаридов. [c.49]

Эти N-концевые последовательности были определены в смеси почти 20 полипептидов, различимых после электрофореза при кислом pH, до достаточно гомогенных по молекулярной массе. Именно этим объясняется тот факт, что в одном и том же положении N-концевой последовательности иногда обнаруживается до 6 аминокислот. Эта вариабельность значительна для первых 10 кислот далее в каждом положении находят не более одной или двух кислот и обнаруживают почти идентичные последовательности для глиадинов с высокой молекулярной массой и спирторастворимых глютенинов. На основании этих результатов была выведена последовательность общего типа. [c.209]

После очистки субъединиц с молекулярной массой 44 ООО Да были обнаружены последовательности трех типов а-последова-тельность, 7-последовательность, произошедшая от агрегированных глиадинов с низкой молекулярной массой, и специфическая последовательность, очень сходная с той, которую можно предполагать по результатам исследований Хюбнера и Уолла [100] (табл. 6Б.15). Было подтверждено также, что агрегированные глиадины состоят из специфических субъединиц, отличающихся от других глиадинов, как это следует из анализа методом двумерного электрофореза [101]. [c.210]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология