Электрофоретическое разделение в геле

Рис. 9-23. Электрофоретическое разделение разных молекулярных форм лактатдегидрогеназы (ЛДГ), Изоферменты обычно обозначаются цифровыми индексами, указывающими относительную скорость их перемещения при электрофорезе в полиакриламидном или крахмальном геле в стандартных условиях.

Рис. 3-6. Электрофоретическое разделение белков плгрмы человека пятью различными методами при pH 8. а — электрофорез без носителя б — электрофорез на бумаге в — электрофорез в крахмальном геле г — электрофорез в полиакриламидном геле д — иммуноэлектрофорез (полосы прештитации к поливалентной антисыворотке человека). Стрелки показывают положение отдельных белков плазмы.

Принцип метода. Иммуноэлектрофорез представляет собой комбинацию электрофоретического разделения белков с двойной диффузией и иммунопреципитацией в геле. Вслед за электрофоретическим разделением белков в агаровом геле навстречу полученным фракциям диффундирует специфическая иммунная сыворотка. Этот метод позволяет характеризовать белки не только по скорости миграции в электрическом поле, но и по антигенным свойствам. [c.137]

В настоящее время существует множество вариантов как метода Максама — Гилберта, так и метода Сэнгера. Главное, эти методы удалось полностью автоматизировать. Так, например, при секвенировании ДНК по Сэнгеру на 5 -конец праймера вводят флуоресцентные метки, причем для каждого из четырех анализируемых нуклеотидов используются флуоресцирующие агенты с различными спектральными характеристиками. После электрофоретического разделения гель сканируется при четырех различных длинах волн и полученная информация сразу обрабатывается на ЭВМ. При этом все биохимические операции также проводятся роботом. [c.19]

При разделении нуклеиновых кислот используют те же методы, что и при фракционировании белков, однако имеются ограничения, обусловленные большим диапазоном величин молекулярной массы (2-10 —Ы0 ° Да), отклонениями от глобулярной формы, различиями в четвертичной структуре (двухнитевые, однонитевые, кольцевые), значительным отрицательным зарядом в нейтральной области pH. Поэтому методы гель-фильтрации и ионообменной хроматографии не получили широкого распространения при фракционировании нуклеиновых кислот и значительно уступают ультрацентрифугированию и электрофоретическому разделению в геле агарозы, полиакриламидном геле или их смеси. Поскольку величина отрицательного заряда нуклеиновых кислот и продуктов их расщепления мало зависит от pH, а отношение заряда к молекулярной массе сохраняется практически неизменным, разделение нуклеиновых кислот при электрофорезе определяется не их зарядом, а размером молекул. При наличии маркеров с известной молекулярной массой возможно определение молекулярной массы препаратов нуклеиновых кислот и их фрагментов. [c.171]

Электрофорез, процесс разделения молекул, основанный на разной скорости перемещения их в электрическом поле, проводят самыми разными способами. Очень небольшое количество раствора, содержащего смесь белков (например, белков сыворотки крови), наносят в виде тонкой полоски на лист фильтровальной бумаги или ацетата целлюлозы. Лист насыщают буфером и пропускают через него электрический ток. Напряжения в несколько сот вольт достаточно для разделения белков сыворотки в течение 1 ч. Для ускорения процесса и снижения диффузии низкомолекулярных веществ широко используют высоковольтный электрофорез. Прикладываемое напряжение составляет в этом случае 2—3 тыс. вольт. Образец постоянно охлаждают с помощью термостатируемых пластин иногда для той же цели всю систему погружают в сосуд с керосином. Электрофоретическое разделение больших количеств материала проводится в плоских лотках, заполненных крахмальным или каким-либо другим гелем. Одним из наиболее распространенных и чувствительных методов разделения белков является электрофорез в колонке, заполненной полиакриламидным гелем. Этот метод, в настоящее время сильно усовершенствованный, позволяет проводить разделение молекул одновременно и по размеру, и по электрическому заряду его называют методом электрофоретического молекулярного сита 127, 128]. [c.164]

Кроме электрофореза на бумаге, п последнее время широкое распространение получили методы электрофоретического разделения веп еств на полиакриламидном, агаровом геле, крахмале и т. д. [c.38]

Белки, обработанные концентрированным раствором додецилсуль-фата натрия в присутствии р-меркаптоэтанола, распадаются на отдельные полипептидные цепи и приобретают отрицательный заряд, значительно превышающий собственный заряд белковой молекулы. При последующем разделении с помощью диск-электрофореза в полиакриламидном геле белковые зоны распределяются на электрофореграммах таким образом, что подвижность белковой зоны обратно пропорциональна логарифму молекулярной массы. Метод дает возможность определять молекулярные массы субъединиц олигомерных белков. Электрофоретическое разделение можно проводить различными методами. Ниже описаны два из них метод Вебера и Осборн, а также метод, предложенный Лэммли. [c.119]

Проведение электрофореза. Разделение можно проводить как в трубочках (с. 95), так и на пластинах для вертикального электрофореза (с. 97). После обработки ДСН к образцам добавляют сахарозу (до концентрации 10%) и в качестве лидирующего красителя — бромфеноловый синий (до концентрации 0,001%). Образцы исследуемых белков и белков-маркеров наносят на поверхность геля в объеме от 20 до 100 мкл (каждого или смеси нескольких образцов) и осторожно наслаивают электродный буфер. Нагрузка на гель определяется методом окраски гелей, а также способностью того или иного белка связывать используемый краситель. Как правило, при электрофорезе в трубочках удается обнаружить от 20 до 100 мкг белка, при электрофорезе в пластинке — от 4 до 15 мкг. В электродный буфер катодного отделения добавляют ДСН до концентрации 0,1%. Электрофоретическое разделение проводят при комнатной температуре и силе тока 8 мА на трубочку. При этом сначала устанавливают силу тока - [c.120]

Очень важной областью применения радиоавтографии является обнаружение радиоактивного ДНК-зонда после его гибридизации с препаратом ДНК, подвергнутым электрофоретическому разделению. К сожалению, провести гибридизацию в самом геле невозможно, поскольку зонд не может в него проникнуть. Поэтому ДНК после электрофореза переносят на нитроцеллюлозный или найлоновый фильтр по методу Саузерна (Саузерн-блоттинг) или с помощью элюции. Расположение молекул ДНК на фильтре в точности соответствует таковому в геле. Перенесенную на фильтр ДНК подвергают [c.65]

Название студень для полимерных систем было предложено Н. П. Песковым. В настоящее время понятия студень и гель смешивают. Например, структурированную среду для электрофоретического разделения называют поли.акриламидным гелем. [c.224]

Если по окончании электрофоретического разделения белков в агаровом геле навстречу им диффундирует специфическая иммунная сыворотка, то в местах встречи антигена и антител образуются дугообразные полосы преципитации, каждая из которых соответ- [c.20]

Электрофорез. При напряжении 120 В электрофоретическое разделение белков сыворотки крови продолжается 4—5 ч. Оптимальный градиент напряжения 3—6 В/см. В этих условиях можно проводить электрофорез без специального охлаждения и в то же время не опасаться высыхания геля. При увеличении силы тока происходит падение напряжения, поэтому необходимо несколько раз во время сеанса электрофореза проверять напряжение в цепи. [c.139]

Принцип метода. После электрофоретического разделения исследуемого белка в агаровом геле компоненты специфической иммунной сыворотки диффундируют навстречу полученным фракциям через слой агарового геля, содержащий известные (контрольные) антигены, которые абсорбируют соответствующие антитела и. задерживают их дальнейшую миграцию к определяемым антигенам. В результате в образовании полос преципитации принимают участие только те антигены исследуемого образца, которые отличаются от контрольных. [c.150]

Методы электрофоретического разделения в полиакриламидном и агарозополиакриламидном гелях широко используются в настоящее время для фракционирования нуклеиновых кислот. Преимуществом этих методов является их простота и возможность контролировать ве-нДичину пор геля. При наличии маркёров с известной молекулярной массой или коэффициентом седиментации очи могут быть использованы для характеристики относительной молекулярной массы выделенных препаратов нуклеиновых кислот. [c.173]

В работе [41] приводятся данные, показывающие, что связь ЛУК в древесине ели и ольхи в большей степени разрушается иод действием растворяющих агентов, чем ири механическом воздействии. Исследовалась зависимость количества экстрагированного материала от продолжительности размола древесины и режима экстракции [9]. Выход экстрагируемых веществ возрастает при увеличении продолжительности размола с 20 до 300 ч с 6,85 до 15,8% от исходной древесины. Водные экстракты содержат фракции, в которых лигнин и углеводы не разделяются гель-фильтрацией. Доказательством наличия химической связи служит, по мнению авторов, электрофоретическое разделение, показывающее, что часть выделенных фракций содержит неразделимые ЛУК. На гемицеллюлозный характер ЛУК указывает состав иолисахаридов, содержащих звенья арабинозы, ксилозы, маннозы, глюкозы и галактозы. [c.168]

Другой областью применения тонкослойной гель-хроматографии является исследование белков сыворотки и других биологических жидкостей, откуда эти белки удается выделить лишь в очень небольших количествах. Для этих целей разработан хромато-электрофорез в тонком слое [92, 95]. Вслед за электрофоретическим разделением в одном направлении проводят хроматографию в перпендикулярном направлении. Эта техника работы также связана с применением иммунохимических тестов [96]. Исследование этим методом белков Бенс-Джонса в моче открывает перспективы для применения тонкослойной гель-хроматографии в медицинской диагностике [97]. [c.91]

Рис. 27-32. Электрофоретическое разделение олигонуклеотидов по длине цепи на пластинке полиакриламидного геля. Чем короче олигонуклеотиды, тем быстрее они движутся к положительному электроду. Изменяя пористость полиакриламидного геля, данную процедуру можно использовать для разделения довольно длинных олигонуклеотидов, содержащих до двухсот и более остатков, даже если эти олигонуклеотиды различаются всего лишь одним остатком.

Что касается электрофореза в гелях, то следует подчеркнуть его принципиальные отличия от электрофореза в порошкообразных или пористых носителях. Гели служат не только опорной средой для раствора. Они функционируют так же, как молекулярные фильтры, изменяя скорость движения белковых молекул в зависимости от их размеров и формы. Таким образом, сочетаются два метода разделения белков — электрофоретический и основанный на молекулярной фильтрации. В результате эффективность электрофоретического разделения в гелях является наибольшей. Аппаратурное оформление этого метода не имеет принципиальных особенностей. Некоторый недостаток электрофореза в гелях состоит в относительной сложности извлечения фракций из участков геля. [c.32]

Типы аппаратуры, применяемой при электрофорезе на таких носителях, как бумага, мембраны из ацетата целлюлозы, агароза, крахмал и полиакриламидный гель, очень просты (рис. 3.6). Бумага и мембраны из ацетата целлюлозы поддерживаются двумя стержнями, агарозой и гелем крахмала покрывают стеклянные пластинки, а полиакриламидный гель помещают в стеклянные трубки или между двумя пластинками. Образец наносят на носитель, который контактирует с буферными растворами, находящимися в сосудах с положительным и отрицательным электродами. После электрофоретического разделения компоненты можно сделать видимыми при помощи специфических [c.115]

Электрофоретическое разделение белков проводят как в трубочках, так и в тонком слое полиакриламидного геля (слэбе). [c.94]

Секвенирующий гель (Sequen ing gel) Длинная пластина полиакриламидного геля, позволяющая проводить электрофоретическое разделение олиго- и полинуклеотидов, различающихся по длине всего на 1 нуклеотид. [c.559]

Поперечносшитые полиакрилимидные гели оказались прекрасными носителями и разделительными матрицами для электрофоретического разделения белков в способах, основанных на плоском слоевом электрофорезе, таких как ДИСК-электрофорез, ДДСН-ПААГ-электрофорез или ИЭФ. Это указывает на гидрофильный характер таких гелей, которые проявляют только слабые взаимодействия с биомолекулами. В КЭ возможно также покрытие кварцевой поверхности акриламидом. [c.75]

Г. Перекрестный иммуноэлектрофоре.- (65, 94]. Данный метод сочетает электрофоретическое разделение антигенов в первом направлении в геле из агарозы с иммуноэлектродиффузией во втором направлении. [c.102]

Для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот среднего размера обычно применяют агарозные гели. Агароза — это особо чистая фракция, получаемая из агара или непосредственно из агарообразующих морских водорослей. В 1,0% агарозном геле можно разделять молекулы ДНК размером от 600 до 20 ООО п. н. Для фракционирования более крупных молекул ДНК (миллионы пар оснований), денатурированной ДНК и РНК приходится использовать специальные системы электрофореза. Иногда для решения специальных задач для разделения ДНК применяют полиакриламидные гели. Так, в 20% полиакриламидном геле можно разделить фрагменты ДНК, состоящие всего из шести оснований и различающиеся лишь одним нуклеотидом. [c.54]

МИ, проводят гибридизацию in situ с комплементарными им зондами, и если обнаруживается, что эти последовательности встречаются в геноме один раз, то синтезируют пару комплементарных им праймеров и проводят амплификацию СА-повтора. Далее, используя эту пару праймеров, проводят ПЦР-тестирование ДНК, полученной от большого числа индивидуумов. ПЦР-продукты, длина которых для удобства электрофоретического разделения выбирается примерно 200 п. н., разделяют в полиакриламидном геле. Если длина амплифицированного таким образом сегмента ДНК одинакова для всех образцов ДНК, значит, повтор не полиморфен (рис. 20.14, А), и наоборот, если образуются [c.455]

При электрофоретическом разделении нуклеиновых кислот в геле удается разделять фрагменты длиной в сотни нуклеотидов, различающиеся на одно звено. При этом действуют два фактора — удлинение полинуклеотида приводит одновременно к возрастанию заряда и к увеличению сопротивления среды его перемещению. Второй фактор пересиливает, и в связи с этим быстрее перемещаются более короткие полинуклеотидные фрагменты. Примеры злектрофореграмм приведены на рис. 77 и 78. [c.242]

Схема установни для зонного электрофореза приведена на рис. 14.66. Электрофоретическое разделение осуществляется в так назьшае-мой постели, состоящей из пористого материала — носителя. В качестве носителя используют различные вещества — бумагу,, полимерные пленки, гели, порошки. Постель пропитывают электролитом (обычно используют буферный раствор,) концы постели находятся в контакте со свободным раствором электролита, находящимся в двух сосудах в эти сосуды помещают два электрода, соединенных с источником постоянного тока. Электроды находятся в специальных секциях, отделенных от резервуаров с электролитом пористыми перегородками это позволяет [c.465]

Гомогенные гели из полиакриламида широко применяются для электрофоретического разделения белков. Гранулированные гели вполне могут служить носителями для гель-хроматографии в водных средах [11, 12]. Получают гели очень просто. В качестве окислительно-восстановительного катализатора радикальной полимеризации используют главным образом персульфат аммония, а в качестве регулятора — р-диметиламинопропионитрил. Когда слой реакционной массы не слишком велик, полимеризацию можно также инициировать путем облучения видимым светом в присутствии рибофлавина [13]. Готовый гель после лиофильной сушки измельчают в ступке, а затем просеивают или же его продавливают во влажном состоянии через сито с порами соответствующего размера (0,1—0,2 мм). Специальная аппаратура для этой цели описана Хьертеном [14]. Гранулирование можно также проводить, продавливая гель стеклянной пробкой через стальное сито (например, с отверстиями 160 мк) из обычного набора. Величина пор в готовом геле определяется прежде всего общей концентрацией мономера в реакционной массе и во вторую очередь— содержанием бифункционального мономера. Варьируя концентрацию мономера от 4 до 16% при постоянном содержании сшивки 5%, Хьертен [14] получил серию гелей с различной степенью набухания [c.35]

Радиоактивные метки применяют также и в электрофоретических разделениях, причем методы регистрации активности в основном не отличаются от используемых в БХ и ТСХ. Электрофорез в полиакриламидном геле является единственным исключением. В этом случае требуется применение специальных методов. В связи с этим в гл. 5 рассматриваются отличия радиоэлектрофореза от радиохроматографии. [c.10]

Более практичным и эф- Поп проницаеыые мембраны фективным оказался, однако, электрофорез с применением тех или иных опорных сред, так называемый зональный электрофорез, т. е. электрофорез в растворах, которыми пропитывается какой-либо твердый пористый или порошкообразный носитель — фильтровальная бумага, крахмал, целлюлоза, стеклянный порошок и др. Еще более эффективным, хотя и менее удобным для препаративных целей, оказалось электрофоретическое разделение в гелях — агар-агаровом, крахмальном, полиакриламидном. [c.31]

Электрофорез на тонких слоях геля крахмала применяли для разделения белков сыворотки [191—193]. Для обнаружения фракций белка слои геля крахмала окрашивали красителем амидным черным 10 В. Обнаружение и идентификацию зон, разделенных электрофоретически, осуществляют методом иммуно-электрофореза. Корнгольд [194] использовал метод, при котором зоны, полученные электрофорезом геля крахмала, диффундировали в слои агара, где они реагировали с нанесенной антисывороткой. Для этого после завершения электрофоретического разделения слой крахмала подрезали лезвием бритвы и осторожно переносили на слой агарового 1,2 %-ного студня. По- [c.516]

Борковский и др. [94] разделяли основания ДНК, аденин, гуанин, цитидин и тимин методом электрофореза на слоях агарового геля, используя 0,1 М буферный раствор ацетата натрия и уксусной кислоты (pH 3,7). Электрофорез, проводили в течение 45 мин при напряженности поля 5—7 В/см. Образец получали в результате 60-минутного гидролиза ДНК 72 %-ной хлорной кислотой, а после гидролиза выпаривали хлорную кислоту, освобождая основные соли. Цанев и др. [95] изучали влияние концентрации РНК, величины pH, температуры, состава буферного раствора и концентрации геля на фракционирование и подвижность РНК при электрофорезе на слоях геля. Для электрофоретического разделения АМР, ADP, АТР [96] и смесей аденина, аденозина, адениловой кислоты и ди- и трифосфатаденозинов [97] применяли также гель агарозы. [c.136]

Ригетти и Дрисдейл [103] исследовали возможность разделения нуклеотидов методом изоэлектрической фокусировки на полиамиде. Катон и Гольдштейн [104] провели электрофоретическое разделение РНК на геле полиакриламида с линейным градиентом от 2,5 до 12 % На одном и том же геле можно разделить с хорошим разрешением все РНК от 4S до 28S. Джеппезен [105] использовал линейные градиенты от 3,5 до 7,5 % и от 2,5 до 7,5 % для разделения фрагментов ДНК. Полученные полосы были более четкими, чем при обычном электрофорезе на слоях геля. [c.136]

Электрофоретическому разделению веществ мешает их диффузия. Среда, в которой мигрируют молекулы, сама по себе в какой-то мере препятствует диффузии, однако еще в большей степени можно подавить этот эффект и одновременно увеличить подвижность сравнительно небольших молекул с помощью высокого напряжения (высоковольтный электрофорез). В некоторых случаях гели выполняют роль сит. Например, в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия разделение предварительно дентурированных белков происходит в соответствии с размерами их молекул. При проведении электрофореза в градиентном геле разделяемые вещества мигрируют в направлении уменьшения диаметра пор геля, и поэтому с увеличением расстояния от старта задерживаются все более мелкие молекулы. [c.28]

Для разделения канамицинов были использованы методы бумажной хроматографии [39, 52—55], ТСХ [39, 54], электрофореза [56], ГЖХ [57] и ВЭЖХ [58]. Производные канамицина и его биосинтетические продукты были разделены с помощью бумажной хроматографии [59, 60] и ТСХ [60—63]. Для разделения компонентов неомицина и его N-ацетилпроизводных были применены разнообразные системы бумажной хроматографии. [39, 60, 64—75]. Для этой же цели пригодны тонкослойные пластинки с силикагелем [75—79], углем [80], оксидом алюминия [81, 82], целлюлозой MN-300 [76, 83] и с кизельгуром [76]. Электрофоретическое разделение неомицинов осуществлено на ацетате целлюлозы [84, 85], на бумаге ватяан № 3 ММ [46] и в полиакриламидном геле [86]. Описан также газохроматографический анализ неомицинов [87, 88]. [c.147]

Сложные смеси РНК, имеющих одинаковую молекулярную массу, но различную нуклеотидную последовательность, можно разделить с помощью электрофореза в градиенте концентрации денатурирующего агента. Возможности этого метода продемонстрированы Гроссом и др. [88] на примере электрофоретического фракционирования гистоновых мРНК морского ежа в гелях, содержащих мочевину (рис. 10.6). Мочевина оказывает дестабилизирующее действие на систему внутримолекулярных водородных связей, а при низких значениях pH способствует протонированию остатков аденозина и цитозина. Поэтому по мере увеличения концентрации мочевины все более четко проявляется зависимость величины заряда молекул РНК от их нуклеотидного состава и размеров, и эта зависимость находит отражение в изменении подвижности молекул РНК в ходе их электрофоретического разделения. [c.179]

Электрофоретическая подвижность двухцепочечных ДНК в полиакриламидном или агарозном геле пропорциональна логарифму их молекулярной массы [107]. По вышеизложенным причинам это соотношение справедливо лишь в случае фрагментов со сравнительно низкой молекулярной массой. Для электрофореза обычно используют трис-буфер с низкой ионной силой, доведенный до pH 7—8 путем добавления NaH2P04, борной или уксусной кислоты [107]. Выбор геля определяется размерами фрагментов, которые необходимо разделить. Электрофоретическое разделение фрагментов, содержащих менее 400 пар нуклеотидов, проводят в 2—10%-ных полиакриламидных гелях, фрагменты длиной в 400—1000 пар нуклеотидов разделяют в комбинированных полиакриламид-агарозных гелях, а более длинные фрагменты —в 0,5—1,0%-ных агарозных гелях [107]. Соединения, существенно различающиеся по молекулярной массе, можно разделить в градиенте концентрации полиакриламидного геля [106]. [c.184]

Недавно было показано, что нуклеопротеиды [147] и другие белки [148], разделенные с помощью гель-электрофореза, можно перенести на нитроцеллюлозные или диазобензилоксиметилцел-люлозные фильтры. Более того, белки после такой процедуры сохраняют способность связываться с ДНК [148]. С помощью этого метода, по-видимому, можно выделить и охарактеризовать белки, взаимодействующие с ДНК или РНК. В работе [149] показано, что /ас-репрессор из Е. соИ специфически удерживается на колонке с диазобензилоксиметилцеллюлозой, содержащей ковалентно связанные фрагменты /ас-оператора Е. соН. В отличие от электрофоретического разделения, которое требует соблюдения весьма специфических условий, этот тип аффинной хроматографии идеально подходит для изучения влияния ионной силы, pH и температуры на эффективность взаимодействия белков с нуклеиновыми кислотами. Такого рода аффинную хроматографию, вероятно, можно использовать для очистки белков, контролирующих экспрессию генов. [c.196]