Примеры центрифугирования в градиентах плотности растворов

В предыдущих разделах было показано, что центрифугирование в градиенте плотности является ценным методом исследования природных и синтетических полимеров. Если применимость этого нового метода к исследованию полимеров природного происхождения была продемонстрирована уже на многих примерах, так что метод практически стал стандартной операцией для биохимиков и биофизиков, его применение для исследований синтетических полимеров пока ограничено. Только недавно были получены результаты, показывающие, что центрифугирование в градиенте плотности не только применимо к синтетическим полимерам, но во многих случаях имеет преимущества перед другими методами. Эти преимущества особенно очевидны, когда имеются полимеры высокого молекулярного веса или количество полимера в образце очень мало. В качестве примера рассматривалось обнаружение микрогеля и была показана возможность оценки его молекулярного веса. Без труда могут быть определены небольшие различия в плотностях в растворе для двух полимеров. Из данных о концентрации полимера как функции расстояния от центра вращения может быть получена информация о распределении полимеров по молекулярному весу и по химическому составу, причем для смеси полимер-гомологов могут быть оценены значения средних молекулярных весов, включая среднечисловой молекулярный вес. Это позволяет в принципе заменить определение осмотического давления или по меньшей мере использовать эти измерения в качестве дополнения к осмотическому методу, так как при центрифугировании чувствительность повышается с увеличением молекулярного веса в противоположность осмометрии. Вопрос о том, является ли центрифугирование в градиенте плотности подходящим методом исследования микроструктуры полимеров, в общем виде еще не решен. По крайней мере в одном случае (атактический и стереорегулярный полистирол) было показано, что метод действительно применим. Однако до сих пор еще не известно, можно ли в общем случае ожидать, что различия в микроструктуре приведут к достаточным различиям в кажущихся парциальных удельных объемах, чтобы этот эффект можно было использовать для определения степени стереорегулярности. [c.443]

Таким образом, почти единственным (во всяком случае, преимущественно употребляемым) материалом для создания градиентов плотности при зонально-скоростном центрифугировании является сахароза. Остановимся подробнее на свойствах ее растворов, способах образования градиентов плотности, выборе режимов центрифугирования и приведем несколько примеров центрифугирования в градиентах сахарозы. [c.210]

В случае смеси макромолекул с различными значениями 5 при относительно высокой концентрации возникает особая проблема. В этом случае молекулы мешают седиментации не только себе подобных, но и других типов молекул. К тому же молекула с большим S и большей концентрационной зависимостью, должна седиментировать через раствор более медленно движущихся молекул. При высокой концентрации более быстро осаждаемые молекулы будут так задерживаться, что они седиментируют почти с той же скоростью, что и более медленно осаждаемые молекулы при этом может происходить маскировка того факта, что в действительности имеется смесь, и можно получить ошибочную информацию о гомогенности материала. Этот процесс носит название эффекта Джонстона — Огстона. На деле для разделения больших молекул нуклеиновых кислот часто приходится работать с очень низкими концентрациями, поскольку только в этих условиях происходит разделение двух компонентов. Однако даже при этих концентрациях полученные данные показывают меньшее содержание более быстро осаждаемого компонента, чем имеется в действительности. Пример этого дан на рис. 11-14. Как будет показано ниже (см. разд. Зональное центрифугирование в предварительно подготовленном градиенте плотности ), эта трудность сводится к минимуму при использовании метода зонального центрифугирования. [c.294]

Ниже рассмотрены особенности каждого из названных солевых градиентов. Различные технические аспекты их приготовления и использования подробно проанализируем на примере самого распространенного — градиента плотности растворов s l. Затем отметим особенности и принципиальные отличия других солевых градиентов. Отдельно остановимся на равновесном центрифугировании в градиентах плотности растворов метризамида. [c.250]

Только что рассмотренный пример касался бакет-ротора, однако равновесное центрифугирование в градиенте плотности растворов s l лучше вести в угловых роторах. Рассмотрим процесс образования градиента в этом случае (рис. 65). [c.253]

Примеры центрифугирования в градиентах плотности растворов s l [c.259]

Приведем несколько примеров использования равновесного центрифугирования в градиенте плотности растворов saSO. [c.264]

Используя соответствующую соль, можно создать устойчивый в условиях центрифугирования градиент ее концентрации, а тем самым и градиент плотности растворителя. Если природа соли и распределение ее концентрации таковы, что плавучая плотность биополимера выше, чем плотность растворителя на мениске, но ниже, чем у дна пробирки, то по мере перемещения к дну пробирки биополимер достигнет участка, где множитель 1 - / о/р станет равным нулю и дальнейшая седиментация прекратится, т.е. возникнет устойчивая зона нахождения биополимера. Наиболее широкое применение для этой цели нашли растворы солей цезия, которые позволяют получить растворы с плотностью, достаточной для остановки перемещения нуклеиновых кислот. Эксперименты подобного рода весьма дороги, так как требуют длительной, обычно на протяжении нескольких суток, работы ультрацентрифуг. Однако они открывают некоторые уникальные возможности. Например, удается разделить биополимеры, различающиеся лишь изотопным составом. Молекулы ДНК из одного вида микроорганизма, выращенные на средах, содержащих в качестве источника азота соли аммония и 15NH4, не отличаются по объему, но имеют разные массы и, следовательно, различные плавучие плотности. Поэтому при равновесном центрифугировании и градиенте плотности хлорида цезия они образуют отдельные зоны. Пример применения этого метода для доказательства полуконсервативного характера репликации ДНК приведен в 5.1. [c.244]

Первый эксперимент с применением метода центрифугирования в градиенте плотности [461] особенно наглядно продемонстрировал значение этого метода. В этом эксперименте бактерии выращивались на среде, богатой № , и поэтому дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) организмов, меченных изотопом тяжелого азота, обладала несколько большей плотностью, чем обычная ДНК. Через определенное время бактерии переносили в среду с обычным распределением изотопа азота и методом центрифугирования в градиенте плотности анализировали изменения плотности ДНК, выделенной из ряда последовательных генераций клеток. На основе предположения Уотсона и Крика [30] было принято, что редупликация ДНК во время деления клеток включает разделение двух цепей двойной спирали (см. стр. 130), причем каждая цепь служит матрицей для синтеза дополняющей ее цепи. Если этот механизм достоверен, то вторая генерация клеток, происходящих от клеток, меченных N , должна содержать ДНК, в которой изотопом тяжелого азота мечена одна из цепей каждой двойной спирали. В последующих генерациях должно возрастать количество ДНК с обычным распределением изотопов азота, однако при этом сохраняется также некоторое количество наполовину меченной ДНК. В любой данный момент времени в растворе должны присутствовать молекулы ДНК только с тремя четко определенными плотностями и никаких компонентов с промежуточной плотностью обнаруживаться не должно. Это предположение было полностью подтверждено данными по ультрацентрифугированию в градиенте плотности (рис. 55), и поэтому механизм редупликации ДНК, который раньше был лишь плодом смелых теоретических представлений, можно считать в настоящее время окончательно установленным. В относительно короткое время после этого классического эксперимента метод центрифугирования в градиенте плотности различными путями способствовал развитию биохимических исследований. Можно привести несколько примеров, иллюстрирующих это положение. Методом меченых атомов, подобным описанному выше, было установлено, что некоторая часть рибонуклеиновой кислоты (РНК) переходит в последующие генерации клеток в нативной форме [468]. Было найдено, что плотность ДНК является линейной функцией содержания гуанина и цитозина в различных микроорганизмах, и, таким образом, ДНК, выделенная из какого-либо вещества, образует в градиенте плотности полосу с характерным расположением [469, 470]. На диаграмме градиента плотности ДНК, полученной из тканей высших организмов, периодически обнаруживаются сателлит-ные полосы [471], которые могут быть обусловлены симбиозными организмами или другими, еще неизвестными причинами. Типичный пример этого эффекта изображен на рис. 56, который, между прочим, наглядно свидетельствует также о чувствительности метода обнаружения малых [c.165]