Гибридизация по Саузерну

Рис. 20.11. Использование рестрикционных сайтов в качестве генетических маркеров. А. Замена одной пары нуклеотидов в рестрикционном сайте приводит к тому, что рестриктаза не распознает его и не расщепляет ДНК. Интактный и измененный сайты рестрикции отмечены знаками (+) и (—) соответственно. Б. Участок одной хромосомы, содержащий три сайта (А, 1 и В), узнаваемые одной и той же рестриктазой. X - расстояние между сайтами А и 1, У - расстояние между сайтами 1 и В, X + У -расстояние между сайтами А и В. Сайты А и В во всех случаях интактны (оба +), а сайт 1 может быть как интактным (+), так и измененным (-). Если сайт 1 интактен (+), то после обработки ДНК рестриктазой образуются фрагменты X и У. Если же он изменен (—), то образуется единственный фрагмент (X + V). Если провести блот-гибридизацию по Саузерну с зондом а, то мы обнаружим фрагмент X в том случае, если сайт 1 интактен (+), и фрагмент (X + V), если он изменен (-). В. Фрагменты, образующиеся после обработки рестриктазой, и фрагменты, выявляемые при гибридизации по Саузерну с зондом а, для каждого из генотипов (+/+, +/-, -/-). Г. Фрагменты одной хромосомы, образующиеся после обработки рестриктазой, и фрагменты, выявляемые при гибридизации с зондом Р или у.

Для идентификации трансгенных животных вьщеляют ДНК из маленького кусочка хвоста и тестируют ее на наличие трансгена с помощью блот-гибридизации по Саузерну методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Чтобы определить, находится ли трансген в клетках зародышевой линии животного, трансгенную мышь скрещивают с другой мышью. Далее можно проводить скрещивание потомков для получения чистых (гомозиготных) трансгенных линий. [c.421]

Для проведения гибридизационного анализа в растворе требуется большое количество ДНК. Дополнительные затруднения связаны также с возможностью перекрестной гибридизации между гомологичными генами человека и мыши. Многие из этих трудностей могут быть преодолены с помощью блот-гибридизации по Саузерну. На первом этапе соответствующий ДНК-зонд метят радиоактивными изотопами (такими, как Р или Н) с помощью ник-трансляции. Затем из гибридных линий клеток, несущих определенные хромосомы человека, выделяют препараты тотальной ДНК. Как показано на рис. 18.17, эти препараты ДНК [c.308]

Таблица 1.4. Условия гибридизации по Саузерну

Гибридизация по Саузерну. Гибридизация по Саузерну позволяет получить информацию о перекрывании фрагментов различных рестрикций и "обойти" этапы поиска вилок и вложений, перейдя сразу к построению рестрикционной карты по интервальному графу (разд. 5.3). Помимо это- [c.186]

Метод гибридизации по Саузерну, соединенный с подходами, разработанными для генетического анализа соматических клеток, с успехом применялся не только для картирования определенных генов (табл. 18.4), но и для локализации последовательностей ДНК с неизвестными функциями, найденными в библиотеках генов человека. [c.311]

Метод Нозерн -гибридизации по существу идентичен гибридизации по Саузерну и детально описан в табл. 1.5. [c.29]

Рис. 6.6. Вариант ДНК может возникнуть из-за различной длины тандемных повторяющихся последовательностей. Последовательности Л, Б, В и Г различаются на один повторяющийся сегмент таким образом, последовательность А имеет 6 повторов, а Г-3 повтора. Сайты рестрикции отмечены стрелками. Эти сайты не изменяются. Однако размер фрагментов ДНК варьирует в зависимости от числа повторов. Наименьшая хромосома Г будет двигаться быстрее различные размеры ДНК при гибридизации по Саузерну различаются по миграционной подвижности. Гетерозиготы по различным комбинациям показаны схематически (А/Б, Б/В и т. д.) [60].

Типы полиморфизма ДНК. Наиболее распространенный тип полиморфизма ДНК-рестрикционный полиморфизм. Если в сайте узнавания для какой-то рестриктазы происходит точечная мутация, фермент не распознает свой сайт и не разрезает ДНК (рис. 2.84). Имея под рукой специфические ДНК-зонды и рестриктазы, можно анализировать ДНК. Рестрикционные фрагменты ДНК (рестрикты) различаются по длине (полиморфизм по длине рестрикционных фрагментов). Они идентифицируются по различной подвижности после гибридизации по Саузерну (рис. 6.5). В настоящее время метод гибридизации по Саузерну включает радиоактивное мечение. Вероятно, в будущем появится возможность нерадиоактивного мечения фрагментов ДНК. Точечные мутации, заменяющие один нуклеотид на другой в некодирующем районе ДНК, встречаются очень часто. Немногие систематические исследования изменчивости ДНК проводились путем анализа с использованием большого количества рестриктаз в небольшой выборке особей (10 12). Результаты, полученные для хорошо изученных к настоящему времени областей генома (гемоглобина, альбумина и сегментов ДНК с неизвестной функцией из разных хромосом) [1143 1742 1959], свидетельствуют о том, что уровень нуклеотидной изменчивости приблизительно на порядок выше, чем наблюдаемый по структурным генам, кодирующим белки. Это означает, что разница между случайно выбранными хромосомами составляет в среднем 75оо" 7г5о нуклеотидов (гетерозиготность = = 0,001 — 0,004). Особенно подходят для выявления вариантов ДНК ферменты Мер и Тая1, узнающие метилированный динуклеотид СрО. Большинство вариантов по длине рестрикционных фрагментов диморфны, т. е. имеют только два аллеля -присутствие ( + ) или отсутствие ( —) сайта рестрикции. Частота полиморфного ва- [c.288]

В большинстве экспериментов качество и количество плазмидной ДНК, поглощаемой протопластами, оценивались физическими методами, например гибридизацией ДНК (блот-тинг-гибридизация по Саузерну), или косвенно путем транзиторной экспрессии маркерных генов либо селекции резистентных к антибиотику, стабильно трансформированных колоний. [c.198]

Ш1. Определяют концентрацию ДНК в реакции с дифениламином (разд. 4.6). Если концентрация ДНК не существенна, то обычно для обнаружения одной копии гена на одной дорожке методом блоттинг-гибридизации по Саузерну (разд. 6.2) достаточно около 7—10 мкл препарата нуклеиновых кислот, обработанного рестриктазами . Как и в случае мини-препаратов (т. е. небольших количеств) ДНК, полученных СТАВ-методом, важно, чтобы рестриктазы были добавлены в избытке и инкубация продолжалась 3—4 ч >. [c.251]

Анализ ДНК путем рестрикции и гибридизации по Саузерну [c.277]

В данную главу включено подробное описание обработки ДНК рестриктазами, электрофореза в агарозном геле, а также переноса и гибридизации по Саузерну. Этот подход составляет основу многих методик, описанных в гл. 1, 3, 4 и 6. [c.277]

Если расстояния от сайта А до сайта 1 и от сайта 1 до сайта В не совпадают, каждое из них не превышает 20 т. п. н. и существует одноко-пийный зонд, гибридизующийся с участком ДНК между сайтами А и 1 (рис. 20.11, Б), то после блот-гибридизации по Саузерну и разделения в агарозном геле фрагментов ДНК, полученных в результате обработки ЯшёПТ, мы сможем различить две ситуации. Первая - сайт 1 расщепляется, в результате чего образуется два фрагмента, и зонд гибридизуется с тем из них, который ограничивается сайтами А и 1. Вторая - сайт 1 не расщепляется и зогщ гибридизуется с фрагментом ДНК, ограниченным сайтами А и В (рис. 20.11, Б). [c.453]

Рестрикционный анализ ДНК позволяет выявить различия в отдельных нуклеотидных парах, появляющиеся в результате мутаций в сайтах, узнаваемых соответствующим ферментом. В случае серповидноклеточной анемии происходит замена АТ на ТА в шестой паре нуклеотидов гена, кодирующего Р-цепь гемоглобина человека замена происходит в сайте (СТКАО), чувствительном к рестриктазе Ойе (рис. 9.19). Фрагменты ДНК, возникающие под действием Ос1е1 у здорового человека и больного серповидноклеточной анемией можно сравнить с помощью метода гибридизации по Саузерну, используя в качестве зонда радиоактивно меченную ДНК гена Р-глобина, как это показано на рис. 9.19. Таким способом можно определять присутствие вредного мутантного гена в геноме эмбриона за несколько месяцев до рождения. Для этого культивируют зародышевые клетки, взятые при амниоцентезе. ДНК этих клеток экстрагируют и подвергают анализу. Такая диагностическая процедура может производиться в тех случаях, когда существует подозрение, что оба родителя-носители вредного рецессивного гена. Следует заметить, что в большинстве случаев вредные мутации происходят вне сайтов, узнаваемых рестриктазами. Однако иногда такие мутации оказываются в хромосомах тесно сцепленными с сайтами рестрикции, что может во многих случаях использоваться в пренатальной диагностике. [c.288]

Для обнаружения таких участков ДНК проводят мягкое разрушение клеток, не сопровождающееся разрушением ядер. Аликвоты ядерной фракции подвергают действию возрастающей дозы нуклеазы типа ДНКазы I, которая вносит одноцепочечные разрывы в двухцепочечную ДНК. После этого из каждой аликвоты выделяют ДНК и подвергают ее расщеплению определенной рестриктазой. Полученные препараты анализируют с помощью электрофореза и гибридизации по Саузерну [c.221]

Рис. 18.17. Картирование клонированных генов человека при использовании гибридов соматических клеток мыши и человека с помощью блот-гибридизации по Саузерну. Присутствие хромосом человека определяется при цитологическом изучении гибридных клеток. Ферменты, служащие маркерами данных хромосом, выявляются с помощью гель-электрофореза. Рестрикционные фрагменты ДНК, выделенной из гибридной линии, разделяют электрофорезом в агарозном геле и переносят на нитроцеллюлозный фильтр. На этом фильтре проводят их гибридизацию с зондом, меченным радиоактивными изотопами. (По Shows ТВ. et al, 1982. Adv. Hum. Genet., 12, 341-452.)

Результаты эксперимента по картированию гена химотрипсиногена В (СТКВ) приведены в таблице 18.3. Плюсы и минусы во втором столбце таблицы отражают результаты гибридизации по Саузерну. Следующие столбцы таблицы указывают на присутствие тех или иных хромосом человека в гибридных линиях. Единственная хромосома, которая имеется во всех гибридных клеточных линиях, дающих положительный ответ в блот-гибридизации, и отсутствует в линиях, дающих отрицательный ответ,-это хромосома 16. [c.311]

ДНК-зонды, содержащие последовательности искомых генов, дают возможность идентифицировать эти гены, даже если они и не экспрессируются. Это можно сделать с помощью таких методов, как гибридизация в растворе (достаточно устаревший подход), гибридизация по Саузерну и гибридизация in situ. [c.291]

Использование РНК-зондов в блот-гибридизации по Саузерну, по-видимому, увеличивает чувствительность метода — главным образом из-за отсутствия конкурентной гибридизации зонда на себя , препятствующей гибридизации зонд—мищень (такая же чувствительность может быть достигнута и при использовании кДНК или других одноцепочечных ДНК-зондов но такие зонды, как правило, сложнее получить). [c.29]

Количество копий специфической последовательности ДНК можно оценить с помощью блот-гибридизации по Саузерну. Приготовление ДНК из культивируемых клеток описано в гл. 6 книги II данной серии [34], а техника переноса на иитроцеллю-лозный фильтр и гибридизации с клонированным зондом хорошо изложены в работе [27], и в данной главе мы не будем возвращаться к ним. Общая постановка эксперимента показана на рис. 8.8, [c.262]

Опыты с ДНК, выделенной из клеток опухолей, также свидетельствуют о существовании онкогенов. Метод обнаружения клеточных онкогенов получил название переноса геиов или трансфекции . Он основан на том, что некоторые гены, присутствующие в опухолевых клетках, могут вызывать трансформацию нормальных клеток в культуре. Из опухолевых клеток выделяют ДНК, осаждают фосфатом кальция и добавляют к клеткам-реципиентам (обычно в этой роли выступает линия мыщиных фибробластов NIH/3T3). Через 1—2 недели под микроскопом наблюдают образование фокусов трансформации. Клетки, составляющие фокус, меняют свою морфологию из распластанных они становятся округленными. Из трансформированных клеток выделяют ДНК, и опыт повторяют. Так делают несколько раз, при этом уменьшается количество ДНК, не участвующей в переносе признака трансформации, и, следовательно, облегчается идентификация специфических генов (при помощи гибридизации по Саузерну (см. гл. 36)). С помощью этого метода было идентифицировано около 20 клеточных онкогенов некоторые из них сходны с геном ras вируса саркомы мыщей. Эти клеточные онкогены либо вообще не отличаются от нормальных генов, либо имеют небольшие структурные особенности (см. ниже). В первом случае при опухолевом перерождении может меняться регуляция их экспрессии. [c.359]

Рис. 6.5. Три индивида, два из которых (А, С) гомозиготны по различным ПДРФ-гаплотипам, а третий (В) гетерозиготен. Принципы анализа и результаты электрофореза в агарозном геле и гибридизации по Саузерну

Следует отметить, что тестирование активности NPT-II и блоттннг-гибридизация по Саузерну в случае Km -каллусов льна и регенерированных Кт -побегов обеспечивает строгое доказательство того, что в описанных выше условиях вырастающий на гипокотилях льна Кт -каллус представляет собой результат одного или очень небольшого числа первичных событий трансформации и, видимо, целиком состоит из клональных потомков первоначально трансформированных клеток [10]. [c.138]

В данном разделе мы останавливаемся на том, как определить оптимальную концентрацию ПЭГ 6000 для эффективного поглощения плазмиды протопластами растений. Однако ту же самую схему можно использовать и для оптимизации других параметров (например, подбора ДНК-носителя, среды для поглощения, pH, времени и температуры инкубации, концентрации ДНК, условий перемешивания и предварительной обработки протопластов), которые предположительно влияют на процесс поглощения. После стимуляции эндоцитоза любая плазмида, адсорбированная на внешней стороне протопластов, удаляется с помощью ДНКазы. Затем из заданного количества протопластов выделяют суммарную ДНК и оценивают количество встроенного в нее вектора с помощью ДНК-ДНК-гибридизации, используя радиоактивно меченную ДНК вектора в качестве пробы. Кроме того, для установления целостности поглощенной векторной ДНК можно использовать блоттинг-гибридизацию по Саузерну [11]. Такие методы в сочетании с анализом временной экспрессии вектора в обработанных плазмидой клетках позволяют быстро оптимизировать процедуры трансформации с помощью ПЭГ. [c.204]

В некоторых случаях для тестирования последовательностей чужеродного гена в трансформированной ткани можно использовать метод дот-блоттинг-гибридизации ДНК. Изучение организации чужеродной ДНК, встроенной в геном растения, лучше всего начинать с блоттинг-гибридизации по Саузерну (гл.5 и разд. 6.2). Данный метод позволяет определить копийность встроенных последовательностей ДНК, выяснить, расположены ли эти многочисленные вставки тандемно либо рассеяны по геному, а также оценить стабильность этой ДНК в поколении Fl трансформированных растений. Весьма важно получить как можно больше данных о строении и расположении перенесенных генов в геноме трансформированного растения, поскольку от этого в значительной степени может зависеть их экспрессия и наследуемость. Для подробного анализа организации чужеродной и окружающей ее ДНК требуются такие методы выде- [c.236]

Существенный фактор при выполнении ДНК из растительных клеток — эффективное разрушение клеточных стенок. К сожалению, многие методы, используемые для этого, приводят к фрагментации ДНК. и, следовательно, в каждой конкретной ситуации достигается определенный компромисс между размером ДНК и ее выходом. Эту трудность можно частично преодолеть при использовании лиофилизированного материала (разд. 4.2). Однако высвобождение высокомолекулярной ДНК — это только часть задачи, поскольку экстракты растительных клеток содержат большие количества полисахаридов, таннинов и пигментов, которые в ряде случаев весьма трудно отделить от ДНК. Хуже того, некоторые полисахаридоподобные примеси невозможно определить обычными аналитическими методами, не приводящими к разрушению ДНК- Такие примеси препятствуют правильному определению количества нуклеиновых кислот спектрофотометрическими методами и дают аномальную кинетику гибридизации. Кроме того, что гораздо важнее, они могут подавлять активность большинства ферментов, модифицирующих ДНК, в том числе и ферментов рестрикции. Это может затруднять как анализ ДНК методом блоттинг-гибридизации по Саузерну, так и ее клонирование. [c.237]

Гибридизацию по Саузерну [7] используют для выявления и изучения организации последовательностей ДНК после их разделения с помощью гель-электрофореза. Процедура гибридизации подразделяется на два этапа. Первый этап — перенос разделенных фрагментов ДНК на нитроцеллюлозную мембрану, осуществляемый под действием капиллярных сил (в последнее время применяется электроперенос) таким образом, чтобы относительное положение каждой молекулы ДНК осталось неизменным. Второй этап — гибридизация связанной ДНК с пробами, меченными изотопами (комплементарной ДНК), для выявления определенных последовательностей ДНК. Анализ ДНК по Саузерну включает в себя апуриниза-дию, денатурацию и нейтрализацию ДНК внутри геля с последующим переносом и связыванием нуклеиновой кислоты с мембраной. Далее мембрану инкубируют с одноцепочечной пробой, меченной радиоактивным изотопом, а после отмывания — выявляют гибридизовавшиеся гомологичные фрагменты ДНК путем авторадиографии с использованием рентгеновской пленки. [c.277]

Основная задача данной главы — дать общее представление о рестрикционной обработке различных препаратов ДНК. Подробные указания по обработке мини-препаратов ДНК Е. oli, тотальной ДНК агробактерий и ДНК растений приведены в соответствующих разделах гл. 1 и 4. Указания по нанесению рестрицированных образцов ДНК и детали, связанные с приготовлением индивидуальных проб для гибридизации по Саузерну, широко освещены в других разделах (гл. 1 и 4). Способ заливки агарозных гелей, блоттинг-гибридизация по Саузерну и мечение ДНК с помощью олигонуклеотидной затравки, приведенные в данном разделе, универсальны для всех описанных в других разделах экспериментов и могут применяться без изменений. [c.277]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология