Бактериальная клонирование

С помощью современных генетических методов биологи научились превращать бактерии в своеобразные биологические фабрики по производству белковых препаратов (например, рестрицирующих эндонуклеаз), различных химических соединений, аминокислот, антибиотиков и т. д. Клонируя в бактериальных клетках специфические гены, они создают новые пути биосинтеза для получения уникальных метаболитов, применяют клонированные гены болезнетворных микроорганизмов в качестве зондов для диагностики заболеваний человека и домашних животных, используют изолированные гены для получения безопасных и эффективных вакцин. [c.179]

Векторы для клонирования. Используют для увеличения количества (амплификации) фрагмента ДНК, встроенного в такой вектор, посредством репликации. В этом качестве наиболее часто используются бактериальные плазмиды и фаги. Для клонирования больших фрагментов генома используют векторы — искусственные бактериальные и дрожжевые хромосомы (ВАС и YA ). [c.36]

Клонирование генов бактериальных целлюлаз представляет значительно более простую задачу, чем грибных, так как гены [c.102]

Существуют и другие, более близкие опасности. В 1974 г. Комитет по рекомбинантным молекулам ДНК Национальной Академии наук США обратился с призывом о прекращении экспериментов в двух направлениях, которые могут представить опасность для человечества в целом [269]. В своем обращении комитет подчеркнул, что использование Е. соИ для клонирования рекомбинантных молекул может оказаться опасным, поскольку эти бактерии обитают в кишечнике человека и могут обмениваться генетической информацией с бактериями, патогенными для человека. Комитет считает, что следует добровольно отказаться от исследований в двух указанных им направлениях, которые могут привести к случайному включению в хромосому генов, обусловливающих устойчивость к антибиотикам и к образованию токсинов, а также к развитию опухолей. Особые предостережения были высказаны в отношении любых планов, направленных на сцепление фрагментов ДНК животных с ДНК бактериальных плазмид или фагов. Предполагается, что контроль за проведением такого рода исследований должен осуществляться различными организациями, субсидирующими биохимические исследования [269]. [c.296]

Клонирование ДНК, суть которого сводится к введению ДНК-фрагмента в самореплицирующийся генетический аппарат (плазмиду или вирус), который используют для трансформации бактерий. Бактериальная клетка после трансформации способна воспроизводить этот фрагмент во многих миллионах идентичных копий. [c.106]

Бактерии можно не только использовать как фабрики для синтеза белков типа рестриктаз, но и получать с их помощью новые продукты, изменяя метаболизм бактериальных клеток введением в них чужеродных генов или модификацией уже существующих. Можно создавать рекомбинантные микроорганизмы, способные синтезировать самые разные низкомолекулярные соединения Ь-аскорбиновую кислоту, краситель индиго, аминокислоты, антибиотики, мономерные единицы различных биополимеров. Общая стратегия при этом состоит во введении в организм хозяина специфических генов, клонированных в подходящем векторе, которые кодируют один или несколько ферментов, катализирующих не свойственные микроорганизму метаболические реакции или влияющих на осуществляемый им в норме биосинтез определенных соединений. По имеющимся данным, создание новых метаболических путей не является технически неосуществимым. Этот подход поможет создать необычные, более эффективные пути синтеза самых разных соединений. [c.272]

Под биомассой здесь понимается вся совокупность веществ и материалов, побочных продуктов пищевой и перерабатывающей промышленности, которая может служить сырьем для получения ценных продуктов. Производство этанола или фруктозы из молотого зерна происходит в несколько ферментативных стадий. Участвующие в этих процессах ферменты часто используются однократно. Чтобы повысить эффективность ферментативных реакций и снизить стоимость процессов, исследователи занимаются клонированием и исследованием свойств бактериальных генов, кодирующих термостабильные, обладающие высокой каталитической активностью и устойчивые к действию спирта ферменты. [c.302]

Иногда понятия "генная инженерия" и "биотехнология" отождествляются (А А Баев, 1984), хотя несомненно генная инженерия представляет собой один из методов науки биотехнология В основу генноинженерных методов заложена способность ферментов — рестриктаз расщеплять ДНК на отдельные нуклеотидные последовательности, которые могут быть использованы для встраивания их в геномы бактериальных плазмид и фагов с целью получения гибридных, или химерных форм, состоящих из собственной ДНК и дополнительных встроенных фрагментов несвойственной им ДНК Поэтому методами генетической инженерии добиваются клонирования генов, когда выделяют нужный отрезок ДНК из какого-либо биообъекта и затем получают любое количество его, выращивая колонии генетически идентичных клеток, содержащих заданный участок ДНК Другими словами клонирование ДНК — это получение ее генетически идентичных копий [c.179]

Метод клонирования нашел множество новых применений. С помогцью микробов можно получать большие количества чужеродной ДНК, чтобы исследовать ее. Если в бактериальной клетке происходит экспрессия генов такой ДНК, это позволяет микробиологическим путем получать, например, гормоны и ферменты. Новый метод может быть применен на пользу человека поскольку, однако, конструирование [c.470]

Преимуществом фагов как векторов является возможность клонирования больших фрагментов ДНК по сравнению с теми, которые могут переносить плазмиды. Чаще других для этой цели используют фаг К (рис. 2.20). Часть фаговой ДНК заменяют на ДНК, которую нужно клонировать. Эта часть не нужна для репликации фаговой ДНК в бактериальной клетке-хозяине, поэтому клонирование не нарущается. Схематически эта процедура представлена на рис. 25.7. [c.222]

Использование бактериальных плазмид в качестве векторов для клонирования. Клетки бактерий содержат хромосомную ДНК. Однако помимо хромосом бактерии содержат большое число небольших (1—25 т. н. п.) кольцевых молекул ДНК. Такие кольцевые молекулы называют плазмидами. Некоторые плазмиды имеют в своем составе гены устойчивости к антибиотикам, представленные большим числом копий. Высокая копийность плазмид обеспечивает клетке синтез большого количества ферментов, биохимически нейтрализующих антибиотики, что и обеспечивает устойчивость бактериальной клетки к последним. [c.37]

Число копий плазмиды в клетке может существенно варьировать. Это зависит от генетических особенностей как клетки, так и плазмиды. Некоторые плазмиды могут размножаться до тех пор, пока их число не достигнет 10— 200 копий на клетку. Другие типы плазмид реплицируются с той же скоростью, что и бактериальная хромосома. Такие плазмиды содержатся в клетке в количестве одной или нескольких копий. Естественно, для целей клонирования используют векторы на основе плазмид первого типа. [c.37]

X [260]. Аналогичным образом гены gfai-оперона Е. соН удалось включить при помощи фага % в геном вируса SV40. Важная особенность зтих методов состоит в том, что в них используется молекулярное клонирование новых комбинаций ДНК, включенных в бактериальную плазмиду [261]. Для этой цели были использованы плазмиды, способные к репликации в клетках Е. соИ. [c.295]

Практически общий способ трансформации и трансфекции основан на том, что при обработке клеток бактерий a l2 их мембрана становится проницаемой для ДНК. Однако эффективность проникновения экзогенной ДНК в клетку довольно низка. Поэтому среди бактерий, подвергшихся трансформации, только небольшая часть оказывается трансформированной. Отделение ее от общей массы осуществляется в процессе клонирования. Для клонирования бактериальную суспензию определенной концентрации выливают на твердую питательную среду, например на агар с питательными добавками в чашке Петри из расчета 5—10 бактерий на 1 см поверхности. Бактериальная клетка на поверхности агара начинает делиться с образованием в итоге маленькой колонии, похожей на шляпку гриба. Эта колония называется клоном, причем из каждой клетки образуется свой клон, все клетки которого имеют свойства бактерии-родоначальника. [c.121]

Вектор (Ve tor) Самореплицирующаяся молекула ДНК (например, бактериальная плазмида), используемая в генной инженерии для переноса генов от орга-низма-донора в организм-реципиент, а также для клонирования нуклеотидных последовательностей. [c.545]

Предварительно клонированные гены вводят в клетку животных различными путями. Суть одного из них состоит в трансформации клеток требуемым геном, соедршенным с одним из генов, для которых осуществляется селекция. Для идентификации и последующего размножения клеток, содержащих интегрированную ДНК, был разработан метод, получивший название метода маркера. Примером может служить метод получения клеток, дефектных по синтезу фермента тимидинкиназы (ТК -клетки). Такие клетки трансформировались фрагментами ДНК вируса герпеса (HSV), содержащего ген фермента ТК, и после трансформации они приобретали способность к синтезу фермента на селективной среде, т.е. становились ТК -клетками. Клетки ТК легко отличаются от клеток TK , поскольку способны расти на средах с ами-ноптерином (ингибитор, блокирующий определенные стадии биосинтеза нуклеотидов), гипоксантином и тимидином. Следовательно, в данном случае для трансформации клеток животных бьши использовапы гибриды бактериальных плазмвд с геном ТК из вируса герпеса. Для этого предварительно проводили клонирование и идентификацию генов в клетках Е. соИ и затем полученная рекомбинантная плазмида вводилась в ТК -клетки. Анализ мето- [c.125]

Экспериментально было показано, что стрессовый ответ у бактерий и высших растений выражается сходно. И у растений, и у бактерий начинается усиленный синтез молекул осмопротекторов, механизм действия которых состоит в установлении осмотического баланса между цитоплазмой и окружающей средой, а также стабилизации белковых молекул. В бактериях биоситнез пролина хорошо изучен, известны гены, кодирующие ферменты этого процесса. Избирательная экспрессия генов осмопротекторов может привести к увеличению адаптационных качеств растения и, следовательно, к увеличению его продуктивности. Поэтому следующим шагом на пути создания устойчивых к стрессам растений было клонирование бактериальных генов, получение векторных конструкций на основе Ti-плазмиды и введение их в растения. Полученные трансгены синтезировали и накапливали пролин в 4—6 раз интенсивнее, чем обычные растения. Трансгенные побеги могли укореняться и расти при концентрации соли в среде 20 г/л (350 мМ). [c.156]

Незначительные ограничения этого метода компенсируются информацией, которая может быть получена из независимых анализов комплиментарных цепей. Применение ферментов в этом методе ограничивается введением метки в концевой фосфат и рестрикционным расщеплением цепей на блоки подходящей длины, примерно в 100—150 остатков, с частичным их перекрыванием. Метод нашел наибольшее применение в определении последовательности оснований контролирующих областей генов, например для исследования дуплекса в 223 пары оснований, представляющего собой ген 5S РНК пекарских дрожжей и имеющего промоторный и тер-минаторньй участки транскрипции [24]. Другой прекрасный пример использования этого метода — установление полной первичной структуры -глобиновой мРНК кролика, структура которой была закреплена получением с помощью транскриптазы соответствующей ей циклической ДНК [25]. В ходе амплификации этой циклической ДНК клонированием бактериальных плазмид (см. разд. 22.3.4) были потеряны 13 остатков с 5 -конца. К счастью, их последовательность удалось установить в результате исследований с использованием метода плюс и минус [26]. Совместное применение этих методов позволило установить последовательность гена длиной в 589 пар нуклеотидов. [c.192]

Экспрессия эукариотических генов в прокариотических клетках не реализуется или реализуется с большим трудом В ядерных генах эукариот имеются интроны, а у бактерий нет системы сплайсинга, поэтому образующиеся чужеродные конечные продукты в бактериальных клетках, как правило, неактивны Однако использование векторных систем (в том числе "челночных") и ПЦР позволило успешно решать проблемы, связанные с созданием рДНК их клонированием и экспрессией в различных реципиентных клетках (прокариотических и эукариотических) [c.208]

При молекулярном клонировании важно, чтобы расщепление донорной и векторной ДНК происходило в строго определенньгх участках (сайтах) с образованием дискретного и воспроизводимого набора фрагментов. Если пропустить хромосомную ДНК через шприц с иглой малого диаметра или обработать ее ультразвуком, то мы получим фрагменты длиной от 0,3 до 5 т.п.н. К сожалению, в ходе этих простых операций разрывы двухцепочечных молекул происходят случайным образом, так что при каждой обработке препарата ДНК получается совершенно новый набор фрагментов. Молекулярное клонирование стало возможным только после вьщеления высокоспецифичных бактериальных ферментов, которые узнают определенные последовательности оснований в двухцепочечной молекуле ДНК и расщепляют обе цепи. Эти ферменты называются рест-рицирующими эндонуклеазами типа II. [c.50]

Таким образом, повышение уровня экспрессии клонированных генов бактериальных целлюлаз хотя бы до значений, свойственных исходным культурам, также насущная задача. Однако имеющийся уже сейчас арсенал методов генетической инженерии, отработанный на амилазах и пуллуланазах, дает основания полагать, что эта задача может быть успешно решена [1]. [c.105]

Научные работы относятся к биохимии и молекулярной биологии. Выполнил основополагающие исследования по выделению первого регуляторного белка, управляющего активностью лактозного гена (оперена), по изучению механизма специфического взаимодействия белков и ДНК, по установлению первичной структуры ряда ДНК, а также по клонированию гена— предшественника инсулина — и синтезу этого белка в бактериальной клетке. Совместно со своим сотрудником А. Мэксемом расщепил (1973) ДНК кишечной палочки посредством фермента — дезоксирибонуклеазы и выделил определенный участок (лак —оператор), который оказался двухцепочечным фрагментом, состоящим из 25 комплементарных пар оснований. Совместно с тем же сотрудником предложил (1977) один из удачных методов расшифровки первичной структуры ДНК, базирующийся на принципе локализации оснований по величине соответствующих фрагментов ДНК. [c.141]

Из фрагментов вирусных и бактериальных хромосом уже выделен целый ряд генов. Что же касается выделения специфических генов из фрагментированных эукариотических хромосом, то реализация этой процедуры все еще остается довольно сложной и трудоемкой задачей. Существует два основных подхода для получения специфических генов, подлежащих затем рекомбинации и клонированию. В одном из них, который получил название шотган (от англ. shotgun-дробовик), всю клеточную ДНК обрабатывают рестриктирующей эндонуклеазой, образующей в местах разрыва выступающие концы. Полученные фрагменты ДНК встраивают затем в плазмиды Е. соИ, раскрытые (т.е. переведенные в линейную форму) с помощью той же самой рестриктирующей эндонуклеазы. В результате образуется чрезвычайно сложная смесь, состоящая, вероятно, из тысяч разных рекомбинантных плазмид, среди которых лишь одна может содержать нужный ген. Для поиска плазмиды, несущей этот ген, разработаны специальные процедуры, которые называют скринингом. Одна из таких процедур описана в разд. 30.17. [c.983]

Многие свойства бактерий, интересные с точки зрения биотехнологии, кодируются плазмидами. Плазмиды — это кольцевые Зйолекулы ДНК, которые стабильно передаются потомству бактериальных клеток независимо от хромосомной ДНК- В генетической инженерии плазмиды используются для клонирования иужных генов. Мы опишем в этом разделе некоторые важнейшие свойства плазмид и обсудим те из них, которые особенно ценны для биотехнологии. [c.303]

Идентификация искомых клонов занимает иногда многое времени. Если же клонирование гена проведено, выявить сходные гены в банках кДНК относительно несложно, если применить метод Грюнштейна и Хогнесса. В этом случае колонии бактерий, содержащих рекомбинантные плазмиды, выращивают на нитроцеллюлозных фильтрах, помещенных на поверхность питательной среды. Затем бактериальные клетки разрушают, а высвободившуюся ДНК денатурируют. При этом она остается связанной с фильтром. Далее на фильтр наносят радиоактивный зонд — денатурированную ДНК или РНК, которая связывается с гомологичной или частично гомологичной бактериальной ДНК- Избыток радиоактивных молекул зонда,, которые не связались специфически с гомологичной ДНК, удаляют промыванием и выявляют лизированные колонии, связавшие зонд, методом радиоавтографии. Бактерии, для которых наблюдалась положительная реакция в этом тесте, можно выделить из дубликата — реплики набора колоний. [c.316]

При молекулярном клонировании (рис. 15.21) используют плазмиды в качестве переносчиков (векторов) для введения в бактериальную клетку и репродукции в ней чужеродной ДНК, которая может быть даже эукариотического происхождения. Для этой цели плазмиду и соответствующую чужеродную ДНК обрабатывают специфической рестрикта-зой, например E oRL В результате из обоих препаратов ДНК [c.469]

Если на первом этапе клонирования использовался метод дробовика , то бактерии, включившие донорную ДНК, совсем не обязательно будут нести фрагмент ДНК с нужным геном. Донорная ДНК представляет собой смесь очень большого числа рестрикционных фрагментов (в случае ДНК человека — до миллиона). Даже в том случае, когда все эти фрагменты клонируются, нужный ген или участок ДНК будет содержать только один из них или несколько. Смесь клонов, полученных таким путем, называется библиотекой. Библиотеку можно также получить, если на первом этапе использовать обратную транскриптазу и смесь мРНК. Иногда это приходится делать, если нужную мРНК нельзя выделить в чистом виде. Таким образом, в тех случаях, когда клонировался не одиночный ген (синтезированный или считанный с мРНК одного типа), после четвертого этапа получают бактериальные культуры в виде библиотек. [c.224]

Смотреть страницы где упоминается термин Бактериальная клонирование: [c.217] [c.122] [c.154] [c.217] [c.70] [c.74] [c.116] [c.249] [c.412] [c.424] [c.522] [c.526] [c.550] [c.102] [c.104] [c.303] [c.434] [c.437] [c.441] [c.200] [c.988] [c.993] [c.305] [c.39]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология