Химерный белок

Рис. 6.8. Очистка химерного белка с помощью иммуноаффинной хроматографии. Антитела к маркерному пептиду химерного белка фиксируют на твердом носителе и пропускают через колонку химерный белок. Маркерный пептид, входящий в состав химерного белка, связывается с антителами, а все остальные белки свободно проходят через колонку. Очищенный химерный белок элюируют из колонки.

Химерный белок не синтезируется [c.116]

Рис. 6.7. Клонирующий вектор системы слияния. Он содержит ген устойчивости к ампициллину (Атр ) в качестве селективного маркера, 5 -концевой сегмент гена ompF, кодирующий N-конец наружного мембранного белка, сайт для рестрицирующей эндонуклеазы АЬс и укороченный ген -галактозидазы (la Z). Ген, который хотят клонировать, встраивают в Ab l-сайт. После транскрипции и трансляции этой генетической конструкции образуется трехкомпонентный химерный белок.

Очень часто чужеродные белки, особенно небольшие, обнаруживаются в гетерологичных хозяйских клетках лишь в минимальных количествах. Такой кажущийся низкий уровень экспрессии кодирующих их генов во многих случаях объясняется деградацией чужеродных белков в хозяйских клетках. Один из способов решения этой проблемы состоит в ковалентном присоединении продукта клонированного гена к какому-нибудь стабильному белку клетки-хозяина. В составе подобной конструкции, получившей название химерный белок , продукт клонированного гена оказывается защищенным от расщепления протеазами хозяйской клетки, что было показано в ходе экспериментов. [c.112]

Применение химерных белков В некоторых случаях конечным продуктом, который предполагается использовать, является сам химерный белок. Например, нередко возникает необходимость в получении антител, узнающих конкретный участок белковой молекулы. Чтобы рещить эту задачу, можно встроить в подходящий вектор сегмент ДНК, кодирующий белковый домен, к которому будут вырабатываться нужные антитела. Образующийся в результате химерный белок и будет служить антигеном. Антитела к стабилизирующему его белковому компоненту, происходящему от хозяйской клетки, можно удалить абсорбцией их на чистом стабилизирующем белке, и тогда останутся только антитела, связывающиеся с нужной аминокислотной последовательностью. [c.113]

Химерный белок синтезируется [c.116]

Иногда стратегия синтеза белка-мишени включает получение этого белка в составе химерного продукта. В чем преимущество такого подхода Как создают химерный белок [c.133]

Некоторые патогенные микроорганизмы действуют опосредованно, вызывая развитие аутоиммунной реакции на инфицированные клетки организма-хозяина. Для таких заболеваний можно создать систему специфического уничтожения клеток-мишеней, сконструировав ген, кодирующий химерный белок, одна часть которого будет связываться с инфицированной клеткой, а другая - уничтожать ее. Эта система не является истинной вакциной, хотя она и действует только на инфицированные клетки, устраняя саму причину развития аутоиммунной реакции. [c.228]

Химерный белок. Ковалентно соединенные белки из разных видов организмов их синтез кодируется химерной ДНК. [c.1021]

Рис. 10-58. Сдвиг рамки при трансляции необходим для образования обратной транскриптазы ретровируса. Вирусные обратная транскриптаза и интеграза образуются при расщеплении большого химерного белка gag-pol, а белки капсида в результате расщепления белка gag, присутствующего в больших количествах Синтез обоих белков начинается в одной точке, но у gag он заканчивается на стоп-кодоне в той же рамке считывания, а при сдвиге рамки в направлении — 1 синтезируется химерный белок. Сдвиг рамки обусловлен локальными особенностями в структуре РНК (к ним относится и показанная на рисунке петля РНК), которые приводят к тому, что гРНК , присоединенная к карбоксильному концу растущей полипептидной цепи, время от времени соскальзывает на один нуклеотид назад в рибосоме и спаривается с кодоном UUU вместо ииЛ, который определял ее включение. Представлена последовательность вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1). (По Т. Ja ks et al.. Nature

Наиболее элегантны опыты с химерными регуляторными белками, где в исследуемый ген вставляли бактериальный оператор, а ген-регулятор модифицировали таким образом, что ответственный за связывание с ДНК участок кодировался бактериальным геном-регулятором. Продукт такого гена — химерный белок-регулятор связывался с встроенным бактериальным оператором и тем не менее активно стимулировал работу дрожжевого гена. Иными словами, последовательность ДНК, с которой связывался белок-регулятор, не играла роли для его действия. Однако упомянутые выще опыты Ванга противоречат и этой гипотезе. Тем не менее сейчас это наиболее вероятная гипотеза, получающая все новые подтверждения. [c.192]

Генетические и в особенности генно-инженерные методы позволяют соединить участок ДНК, несущий регуляторную область и сигнальную последовательность одного белка, с участком ДНК, кодирующими аминокислотную последовательность другого белка. В результате в клетке синтезируется гибридный или химерный белок. Такого рода эксперименты показали, что различные сигнальные последовательности эукариот и прокариот обычно взаимозаменяемы и обеспечивают выведение из цитоплазмы экспортируемых белков. Однако если второй белок в норме является цитоплазматическим, то экспорт его чаще всего не происходит. Иногда это связано с тем, что такие белки содержат внутренние участки, которые напоминают стоп-трансферные последовательности и поэтому застревают в мембране. Кроме того, у прокариот, где экспорт не сопряжен строго с трансляцией, может иметь значение неспособность образующихся химерных молекул принять конформацию, необходимую для последующей их транслокации из цитоплазмы. [c.67]

Если слияние гена-мишени с фрагментом ДНК, кодирующим сигнальный пептид, не приводит к эффективной секреции белкового продукта, приходится использовать другие стратегические приемы. Один из таких приемов, с успехом примененных в отнощении интерлейкина-2, основывался на слиянии гена, кодирующего интерлейкин-2, с геном, кодирующим полноразмерный предшественник мальтозосвязывающего белка, а не только его сигнальную последовательность, и разделении этих генов сегментом ДНК, кодирующим сайт узнавания для фактора Х . Когда такой химерный ген включили в плазмидный вектор и использовали его для трансформации Е. соИ, в периплазме хозяйской клетки обнаружили в большом количестве химерный белок. Обработав его фактором Х , получили функциональный интерлейкин-2. [c.126]

Синтезируясь в Е. соИ, химерный белок образует нерастворимые цитоплазматические включения. Их растворяют в гуанидингидрохлориде и выделяют с помощью быстрого разведения и анион-обменной хроматографии. Полученный таким образом белок с успехом выдержал проверку в контрольной культуре клеток. Однако в организме человека на Pseudomonas-KOMnoHQm химерного белка может возникнуть иммунная реакция, и не исключено, что его придется вводить вместе с каким-либо иммуносупрессантом, например циклоспорином. Нужно иметь в виду, что описанный выше способ борьбы с ВИЧ-ин-фекцией находится на начальной стадии разработки, хотя в будущем и может оказаться весьма эффективным. [c.223]

Получить разрешение на применение вакцины, содержащей химерный белок, очень трудно, поэтому, вероятно, придется субклонировать VP1-последовательность в другом экспрессирующем векторе. Так или иначе, субъединичная вакцина против ящура скоро будет готова для проведения доклинических испытаний. [c.231]

Гибридный белок, химерный белок (Fusion protein) Продукт клонированных совместно двух или более кодирующих последовательностей из разных генов. Представляет собой одну полипептидную цепь. [c.547]

Иммунотоксин (Immunotoxin) Химерный белок, состоящий из двух доменов, один из которых обладает свойствами антитела, а другой - токсина. Первый домен [c.549]

Рис. 10-24. Описание эксперимента, позволяющего выявить в составе белка-активатора а14 у дрожжей, независимые ДНК-связывающие и активирующие транскрипцию домены Функциональный белок-активатор может быть получен при соединении карбоксиконцевой части белка а14 и ДНК-связывающего домена бактериального белка-регулятора (белок 1ехА) методом слияния генов. Полученный таким образом бактериально-дрожжевой гибрид будет активировать транскрипцию дрожжевых генов, если перед этими генами встроить специфический сайт, необходимый для его связывания. А. Нормальная активация транскрипции белком а14. Б Химерный белок-регулятор для проявления своей активности нуждается в сайте ДНК, связывающем белок 1ехА. Аналогичные эксперименты продемонстрировали наличие отдельных доменов

Уже давно в качестве диагностического маркера лейкемии человека использовали так называемую филадельфийскую хромосому, которая возникает в результате хромосомной транслокации t(9 22)(q34 qll). При этом происходит соединение онкогена аЫ с 5 -концевым экзоном гена Ьсг. В результате экспрессируется новый химерный белок b rlahl с молекулярной массой 190 ООО. Чтобы установить наличие или отсутствие взаимосвязи между возникновением нового гена и острой лейкемией у человека, химерный ген человека b rlabl вводили в зиготы мышей и получали трансгенных животных. У последних быстро развивалось заболевание, сходное с таковым человека, и они погибали вскоре после рождения. Таким образом, на модели трансгенных животных была впервые установлена причинная связь между возникновением филадельфийской хромосомы и острой лейкемией человека (см. обзор Тарантул, Мудрик, 1991). [c.202]

Экспрессия целевого белка в составе химерного белка. Данный подход может быть реализован благодаря использованию векторных плазмид или фагов, содержащих бактериальные гены или их проксимальные части. Клонируемый ген вводится в эти векторы так, чтобы регуляторная область бактериального гена оставалась неизменной, а встройка происходила в его структурную часть. При совпадении рамки трансляции бактериального гена с рамкой трансляции встроенного гена синтезируется химерный белок, который обладает по крайней мере частью иммунохимических характеристик целевого экзогенного белка. [c.122]

Оказалось, что взаимодействие 6xHis с Ni-NTA-матрицей не зависит от конформации синтезируемого химерного белка. При этом 6xHis имеет значительно меньшие размеры, чем другие полипептиды-носители. При физиологических значениях pH 6xHis не заряжен и слабо-иммуногенен, поэтому химерный белок может быть с успехом использован для получения антител против целевого белка, кодирующая последовательность которого встроена в вектор pQE. [c.126]

Новые типы лечебных препаратов можно получить, если создать белок, обладающий биологическими активностями, свойственными двум или более неродственным белкам. На принципиальную возможность конструирования таких молекул указывает наличие мультифункциональных природных белков, которые могут различаться по своей организации у прокариот и эукариот. Первую успешную работу в данном направлении выполнили М. Сено с соавторами (1986 г.). Они создали гибридный ген, который кодировал химерный белок, состоящий на N-конце из 135 АК HuIFN-y (делеция 11 АК с С-конца) и из 134 АК интерлейкина 2 человека (IL-2) на С-конце (полная последовательность). Иммунный интерферон соединили с ин- [c.193]

Простота организации вириона и очень высокая гонцентрация вируса, достигаемая при культивировании в клетках Е. соН (более 10 2 частиц в 1 мл), позволили реализовать для нитевидных фагов подход, получивший название фаговый дисплей . Его суть заключается в том, что в составе химерных оболочечных белков нитевидных фагов экспрессируются целевые аминокислотные последовательности, которые после сборки фаговых частиц находятся (представляются) на их поверхности. При этом гены со встройками, годирующими целевые пептиды, находятся внутри таких вирионов в составе упакованного фагового генома, т. е. химерный белок и кодирующий его ген физически сцеплены (рис. 7.8). Гибридные вирионы могут быть селектированы путем аффинного связывания представленных на их поверхности чужеродных аминокислотных последовательностей с какими-либо макромолекулами. Таким образом интересующий исследователя вариант [c.196]

Учитывая, что VA является эффективным индуктором Т- и В-клеточного иммунного ответа, т. е. фактически выполняет роль адъюванта, в лаборатории С. Н. Щелкунова создали рекомбинантный ТК" вирус осповакцины VR18V312, экспрессирующий химерный белок TBI-HBsAg, в котором последовательность TBI состыкована с N-концом поверхностного антигена вируса гепатита В. Такой химерный белок был спланирован исходя из предположения, что он, как и HBsAg, будет способен образовывать надмолекулярные структуры, повышающие иммуногенные свойства ТЫ. [c.396]

Частицы инактивированного вируса яхцура Химерный белок НВсА /142-160 АК Химерный белок 3-Оа1/(137-162 АК)г Пептид 142-160 АК Пептид 137-160 АК [c.436]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология