Гуанидингидрохлорид

Низкомолекулярный П. (характеристич. вязкость [т)] 0,05—0,1 дл/г) синтезируют термич. поликонденсацией в расплаве гексаметилендиамина с гуанидингидрохлоридом. В технике, ввиду близости условий, синтез последнего (из дициандиамида и NH4. I) и П. совмещают в одном процессе [c.624]

Рис. 14. Седиментационные диаграммы каталазы печени быка (4,63 мг/мл) в 5М гуанидингидрохлориде с 0,1 М меркаптоэтанолом [54].

Крайний случай конформационно о изменения — денатурация белков, которая может быть вызвана нагреванием или обработкой различными реагентами, например сильными кислотами и основаниями, мочевиной, гуанидингидрохлоридом и додецилсульфатом натрия. Денатурация приводит к развертыванию молекулы белка, и он переходит в более или менее разупорядоченное состояние (здесь уже почти нет ни спиралей, ни (3-слоев, ни любых других типов регулярной укладки цепи). В денатурированном состоянии амидные группы пептидной цепи образуют водородные связи с окружающими их молекулами воды таких водородных связей значительно больше, чем внутримолекулярных. Специфическая биологическая активность белка при денатурации теряется, изменяются и физические свойства, например меняется константа седиментации, вязкость и поглощение света. Легкость, с которой происходит денатурация белка, и тот факт, что денатурация в принципе обратима, свидетельствуют о том, что различия в энергии между свернутыми конформациями и открытой конформацией статистического клубка невелики. [c.105]

Мочевина или гуанидингидрохлорид вызывают обратимую диссоциацию р-галактозидазы на четыре компонента, которые, судя по измерениям диффузии и седиментации, должны быть одинаковыми по размеру (М компонента около 130 000, а М нативного фермента 518 000) [79]. Были получены гибриды легких молекул этого белка ( С, Ы) и тяжелых молекул ( С, Н) й сопоставлены их плотности при центрифугировании в градиенте [c.402]

Все белки, которые были обследованы в присутствии очень высоких концентраций гуанидингидрохлорида, не содержали остаточных нековалентно связанных структур. Если все существующие дисульфидные связи были разорваны, то каждая полипептидная цепь полностью раскручивалась до конфигурации линейного статистического клубка, так что никакие структурные элементы нативной конформации при этом не сохранялись. Радиус инерции беспорядочно изгибающейся полипептидной цепи является функцией только числа аминокислотных остатков в цепи, а следовательно, функцией молекулярного веса цепи независимо от ее состава. Поэтому такие параметры, как молекулярный вес и гидродинамические параметры, вроде коэффициента седиментации и характеристической вязкости, могут быть прямо связаны друг с другом [137, 146, 147]. [c.424]

После денатурации под действием гуанидингидрохлорида, молекулярный вес продукта диссоциации можно оценить разными методами а) измерением седиментационного равновесия [c.424]

При концентрации гуанидингидрохлорида ниже 5 М диссоциация белков до полипептидных цепей может быть неполной. Например, при возрастании концентрации гуанидингидрохлорида от [c.425]

Оценка молекулярного веса требует знания удельного парциального объема белка, V. Точность установления этой величины в значительной мере оказывает влияние на точность нахождения молекулярного веса. Опубликованные в научной литературе данные относительно влияния концентрированного гуанидингидрохлорида на величину и противоречивы. Кажущийся удельный парциальный объем ряда белков не изменяется или только слабо уменьшается в присутствии гуанидингидрохлорида есть основание считать, что и для белков в 6 М гуанидингидрохлориде [c.425]

УДЕЛЬНЫЙ ПАРЦИАЛЬНЫЙ ОБЪЕМ БЕЛКОВ о В НАТИВНОМ СОСТОЯНИИ И В РАСТВОРАХ ГУАНИДИНГИДРОХЛОРИДА ПРИ 25 °С [c.426]

Гель-фильтрация восстановленных полипептидных цепей в 6М гуанидингидрохлориде позволяет производить оценки молекулярного веса в диапазоне 80000—1000 [147]. В поддиапазоне 40 000—10 000 точность метода 7% и на краях диапазона — 10%. В качестве среды для гель-фильтрации используют колонку Био-Гель А-5М с номинальным содержанием агарозы 6%. Определение молекулярного веса осуществляется по принципу сравнения с белками-маркерами известного молекулярного веса на полулогарифмическом графике зависимости молекулярного веса от коэффициентов распределения либо от где Ve — объем элюирования и Уо — исключенный объем (см. разд. 5.3 и 5.5). [c.427]

Приготовление образцов (на примере каталазы [54]). На 1 мл ЮМ раствора гуанидингидрохлорида (растворенного в 67 мМ калий-натриевом фосфатном буфере, pH 7,6 с 0,2 М р-меркапто-этанолом) наслаивают 1 мл раствора каталазы (концентрация белка 10—20 мг/мл в 67 мМ фосфатном буфере, pH 7,6) быстро перемешивают. При этом раствор белка достигает концентрации 5 М по гуанидингидрохлориду. Затем диализуют его в течение 48 ч против 100 мл 5 М гуанидингидрохлорида, растворенного в 67 мМ калий-натриевом фосфатном буфере, pH 7,6 с 0,1 М р-меркаптоэтанолом. Во время диализа необходимо следить, чтобы вода не испарялась из отделений диализной системы. По окончании диализа все операции должны совершаться с максимальной быстротой, чтобы избежать испарения воды. В противном случае в аналитической ультрацентрифуге, кроме градиента. [c.427]

Плотности и вязкости различных водных растворов гуанидингидрохлорида и мочевины представлены в габл. 2 (разд. 10.2.7.1). [c.427]

Перед использованием гуанидингидрохлорид следует пере-кристаллизовывать следующим образом 250 г соли растворяют в 1 л горячего абсолютного этанола, раствор пропускают через активированный уголь для обесцвечивания и в случае необходимости фильтруют на большой воронке с подогревом. К горячему раствору затем добавляют 500 мл бензола, смесь охлаждают и выдерживают на холоду в течение нескольких часов, прежде чем приступить к отделению игольчатых кристаллов гуанидингидрохлорида. Иногда образуется желтая густоватая примесь в исходном образце, которую можно отмыть ацетоном. [c.428]

Критерии чистоты гуанидингидрохлорида хорошо известны 1) спектр поглощения света 6 М раствора характеризуется постепенным увеличением поглощения с отсутствием пика в интервале от 350 до 230 нм, после чего происходит резкое увеличение оптической плотности до 0,15 оптических единиц при длине волны 225 нм 2) незначительные количества стандартных растворов кислоты или щелочи вызывают большой сдвиг pH раствора гуанидингидрохлорида. [c.428]

Рис. 6.14. Разделение лизата ядер клеток зобной железы теленка на сефадексе 0-150 в 4М растворе гуанидингидрохлорида [41].

Синтезированны.м нуклеиновым кислотам сопутствуют белки.. Разделить такую смесь довольно сложно, так как"отделение белков не должно сопровождаться деполимеризацией нуклеиновых кислот. На рис. 6.14 показаны результаты выделения ДНК из ядер клеток зобной железы теленка [41], проведенного в среде 4М раствора гуанидингидрохлорида, который денатурирует и солюбилизирует белки, не вызывая деструкции высокомолекулярной ДНК. [c.385]

Рис. 6.18. Соотношение между молекулярными массами и величинами Kav при гель-хроматографии на сефарозе 6В при элюировании 6М раствором гуанидингидрохлорида [6].

I — ПС/тетрагидрофуран [37] 2 — статистические клубки белка в смеси 6М гуанидингидрохлорид/0.1 М меркаптоэтанол [26] — вирус табачной мозаики в водном растворе [11) —альбумин, извлеченный из сыворотки бычьей крови, в водном растворе [37]. [c.188]

Синтезируясь в Е. соИ, химерный белок образует нерастворимые цитоплазматические включения. Их растворяют в гуанидингидрохлориде и выделяют с помощью быстрого разведения и анион-обменной хроматографии. Полученный таким образом белок с успехом выдержал проверку в контрольной культуре клеток. Однако в организме человека на Pseudomonas-KOMnoHQm химерного белка может возникнуть иммунная реакция, и не исключено, что его придется вводить вместе с каким-либо иммуносупрессантом, например циклоспорином. Нужно иметь в виду, что описанный выше способ борьбы с ВИЧ-ин-фекцией находится на начальной стадии разработки, хотя в будущем и может оказаться весьма эффективным. [c.223]

Биогель А (фирма Bio-Rad). Носители сферической формы на основе гелей агарозы, содержащие очень мало заряженных групп. Интервал фракционирования определяется концентрацией агарозы в гранулах. Совместим со всеми обычными буферными растворами. Гели, содержащие >2% агарозы, устойчивы к 6 М гуанидингидрохлориду и 7 М мочевине, хотя и может произойти небольшая усадка гели с содержанием агарозы < 2% под действием указанных агентов претерпевают структурную деградацию. Гель устойчив при pH 4 10 устойчив к действию 0,1 М NaOH или 1 М НС1 в течение 2-3 ч может разрушаться под действием окислителей. Интервал рабочих температур 2-30°С размягчается при температуре > 40°С. Замораживание вызывает разрушение гелевой структуры. Поставляют в набухшем состоянии. [c.442]

Сефароза (фирма Pharma ia). Носители на основе гелей агарозы, содержащие очень мало заряженных групп. Интервал фракционирования определяется концентрацией агарозы в гранулах. Устойчив в водных растворах при pH 4 — 9. Может быть использован в растворах, содержащих высокие концентрации солей, мочевины, гуанидингидрохлорида, хотя в условиях, способствующих сильной диссоциации, предпочтительнее использовать сефарозу L. Разрушается под действием окислителей. Плавится при нагревании не следует использовать при температуре > 40°С. Можно стерилизовать химическим способом, например путем обработки диэтилпиро-карбонатом, но не путем автоклавирования. Не замораживать замораживание разрушает структуру зерен. [c.442]

Сефароза L-это носитель на основе поперечно-сшитого агарозного геля, получаемый в результате обработки соответствующего типа сефарозы 2,3-дибромпропаном. Поперечное сшивание повышает химическую, термическую и механическую стабильность. Устойчив при pH 3 -н 14, в 8 М мочевине, 6 М гуанидингидрохлориде, 3 М KS N. Можно использовать во многих органических растворителях и при температурах < 70°С устойчив к автоклавированию при 120°С и pH 7. Разрушается в присутствии окислителей. [c.442]

Сефакрил (фирма РЬагтас1а). Зернистый гель, получаемый ковалентным сшиванием аллил-декстрана N, N -мeтилeн6и aкpилaмидoм. Поперечное сшивание обеспечивает высокую химическую и термическую устойчивость и механическую прочность. Гель может быть использован в водных буферных системах при pH 2 н- 11, в ДСН, 8 М мочевине и 6 М гуанидингидрохлориде и ряде органических растворителей, хотя последние могут вызывать небольшое уменьшение объема геля по сравнению с объемом в воде. Структура геля не меняется при нагревании, гель можно неоднократно автоклавировать при 120°С и pH 7. Поставляется в набухшем состоянии. Благодаря жесткой структуре гель может выдерживать высокое рабочее давление (до 150-300 см Н2О), что позволяет использовать высокие скорости фильтрации (до 25-40 см/ч), которые и рекомендуются при колоночной хроматографии. Для фракционирования со средним уровнем разрешения рекомендуется скорость фильтрации 10 см/ч для высокого разрешения следует использовать более низкие скорости фильтрации. [c.444]

Полимераза дезоксирибонуклеиновой кислоты Е. oli имеет молекулярный вес 109 000 и состоит, вероятно, только из одной полипептидной цепи [59]. Это заключение основано на следующих фактах а) наблюдается отсутствие изменения молекулярного веса после разворачивания полипептидной цепи в растворе 6М гуанидингидрохлорида с 0,ЗМ -меркаптоэтанолом б) обнаружен только один N-концевой остаток метионина в) в присутствии денатурирующих агентов обнаружена только одна зона при электрофорезе в полиакриламидном геле. Насколько нам известно, еще не найден какой-либо другой фермент или белок, имеющий одну-единственную полипептидную цепь с молекулярным весом выше 100 000. Однако молекулы ферментов, состоящие из нескольких полипептидных цепей более высокого молекулярного веса, все же существуют (например, -галактозидаза Е. oli и миозин [60]). [c.396]

В табл. 6.14 дан список белков, использованных Брайсом и Кричтоном [6] для калибровки заполненной сефарозой 6В колонки при элюировании 6М раствором гуанидингидрохлорида, а на рис. 6.18 показана кривая зависимости gM от Kav При определении с применением гель-хроматографии ранее неизвестных молекулярных масс следует помнить, что полученные значения молекулярных масс являются лишь приближенными и их необходимо подтвердить с помощью другого независимого метода, например ультрацентрифугирования. Определяя молекулярные массы методом гель-хроматографии, всегда следует проводить калибровку при данных экспериментальных условиях на нескольких соединениях подобного же типа с различными, но заранее известными молекулярными массами. [c.390]

Известны различные денатурирующие агенты. Высококонцентрированные гуанидингидрохлорид и мочевина используются для денатурации белков чаще всего. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что гуанидингидрохлорид с восстанавливающим агентом (используемым для разрыва дисульфидных связей и предотвращения образования дисульфидных связей из SH-rpynn, освобождающихся при денатурации) является тем агентом, который следует использовать, если ставится задача достижения полной диссоциации молекул белка до составляющих их полипептидных цепей. [c.424]

Опыты по измерению седиментации и диффузии проводят в аналитической ультрацентрифуге. При высокой концентрации гуанидингидрохлорида коэффициет седиментации оказывается обычно в интервале —2 S [51, 64, 64, 146]. В случае ката- [c.424]

Если процесс денатурации идет в отсутствие меркаптоэта-нола, то создается возможность окисления свободных 5Н-групп до дисульфидных мостиков, ковалентно связывающих полипептидные цепи. Этим можно объяснить тот факт, что обработка каталазы гуанидингидрохлоридом без меркаптоэтанола не приводит к снижению ее молекулярного веса, он равен 144 000 вместо 59 000 в присутствии меркаптоэтанола [54]. [c.425]

ДО 2,0 М (в присутствии 0,1 М р-меркаптоэтанола при pH 6,3 и температуре 20 °С) коэффициент седиментации АТФ-креа-тинтрансфосфорилазы, 5 изменялся от 5,1 до 1,9 5. При концентрации гуанидингидрохлорида 0,25 М и ниже ( о, что характерно для ассоциированной формы молекулы нативный фермент имеет коэффициент седиментации 5° , = 5,3 5), а также выше 2,0 М в растворе имеется только по одному компоненту (полностью ассоциированная и полностью диссоциирован- ная, 1,4 5, формы молекулы соответственно). В промежуточном диапазоне концентраций система, кроме того, проявляла тенденцию к образованию агрегатов с коэффициентами седиментации вблизи 20 5 [148]. [c.425]

Измерение вязкости растворов полипептидных цепей при высокой концентрации гуанидингидрохлорида с р-меркаптоэтано-лом показывает, что характеристическая вязкость [т]] зависит от молекулярного веса таким образом, как это предсказывает теория для полимерных цепей в конформации статистического клубка [137, 146]. Молекулярный вес можно оценить по следующему уравнению [c.426]

Перекристаллизованный таким образом гуанидингидрохлорид обычно подвергают дополнительной перекристаллизации либо из почти кипящего метанола с последующим охлаждением смесью сухой лед — ацетон, либо из воды упариванием под вакуумом почти насыщенных при 40 °С водных растворов гуанидингдиро-хлорида. Окончательное высушивание кристаллов проводят в вакуум-эксикаторе над Р2О5. [c.428]

Другой метод состоит в нейтрализации густой массы кристаллов гуанидинкарбоната после перекристаллизации из 50% этанола, очищенной 10%-ной соляной кислотой pH 4,0. Раствор упаривают до получения кристаллов гуанидингидрохлорида. Конечный продукт довольно чистый, но по-прежнему требует перекристаллизации, как описано ранее. [c.428]

Биогель Р — синтетический полимер, и поэтому микроорга-НИЗ.МЫ его не разрушают. Он химически устойчив, однако относительно реакционноспособные амидные группы могут гидролизоваться при предельных значениях pH (особенно в щелочных средах) и образовывать свободные карбоксильные группы, в результате чего гель приобретает нежелательные ионообменные свойства. По данным фирмы, выпускающей биогель, содержание свободных карбоксильных групп очень мало менее 2 мкэкв./г ксерогеля. Биогель устойчив в интервале pH от 1 до 10, в частности, устойчив в растворах мочевины, додецил-сульфата натрия, гуанидингидрохлорида и в органических кислотах (муравьиной и уксусной). Однако Детерман [12] не рекомендует биогель для длительной работы при pH>9. [c.352]

Однако некоторые макромолекулы в процессе гель-хроматографирования ведут себя аномально и не подчиняются указанному соотношению. Такие отклонения наблюдались, в частности, при разделении на сефадексе белков с сильно асимметричными молекулами и некоторых гликопротеинов. Как показал Девидсон [10], эти аномалии можно существенно уменьшить или даже избежать их, если вести хроматографирование в диссоциирующей среде 6М раствора гуанидингидрохлорида на сефарозе 6В. [c.390]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология