Нуклеаза микрококков

Нуклеаза микрококков (стафилококков) [c.124]

В этих системах растворителей можно разделять также и динуклеотиды [35]. Однако в этом случае необходимо увеличить время хроматографирования в обоих направлениях (растворитель должен стекать с края бумаги). Метод особенно эффективен, если исходная смесь содержит только динуклеотиды. Иными словами, продукты ферментативного гидролиза сначала разделяют на фракции по длине фрагментов с помощью хроматографии на колонках или на бумаге (см. Введение ), а для идентификации индивидуальных динуклеотидов используют фракцию, содержащую-только динуклеотиды. На фиг. 5 показано разделение смеси динуклеотидов, содержащихся в гидролизате ДНК после деградации ее нуклеазой микрококка [35]. На фиг. 6 представлена аналогичная картина разделения смеси динуклеотидов после гидролиза ДНК под действием ДНК-азы I (активи- [c.18]

Индивидуальные нуклеосомы можно получить, обработав хроматин ферментом нуклеазой микрококков. Это эндонуклеаза, которая разрезает нить ДНК в местах соединения между нуклеосомами. Сначала освобождаются группы частиц, а потом отдельные нуклеосомы. Мономерные нуклеосомы отчетливо видны на рис. 29.2 в виде компактных частиц (настоящая форма которых похожа на диск см. ниже). Они седиментируют примерно со скоростью 11S, что соответствует общей массе в диапазоне 250000-300000 дальтон. Отношение белок/ДНК составляет около 1,25. Димеры, тримеры и т.д. имеют соответствующие свойства при биохимическом анализе или при наблюдении под электронным микроскопом. [c.360]

Рис. 29.2. Индивидуальные нуклеосомы высвобождаются в результате расщепления хроматина нуклеазой микрококков. Размер отрезка 100 нм.

Простой диагностический тест на присутствие нуклеосом был разработан на основе данных о том, что ДНК в хроматине организована в регулярно повторяющуюся структуру. Если выделенные ядра или хроматин обработать нуклеазой микрококков (или в некоторых случаях просто выделить и обработать экзогенным ферментом), ДНК расщепляется на интегральное множество единиц длины. При этом в результате фракционирования методом электрофореза в геле образуется лестница , пока- [c.361]

Каждая ступенька лестницы представляет собой ДНК, соответствующую определенному числу нуклеосом. Таким образом, можно принять, что существование лестницы , кратной 200 п. н., указывает на нуклеосомную организацию ДНК. При обработке нуклеазой микрококков образуется лестница только примерно из 2% ядерной ДНК, которая переходит в кислоторастворимую фракцию (деградирует до мелких фрагментов). Таким образом, реагирует только часть ДНК, по-видимому соответствующая особенно чувствительным областям. [c.362]

Минимальная нуклеосома была идентифицирована по действию нуклеазы микрококков на нуклеосомный мономер. Реакция этого фермента начинается с введения разреза между нуклеосомами. Но если продолжить реакцию после того, как образованы мономеры, то расщепление [c.362]

Четко ограниченный размер полосы ДНК, образованной в результате первого расщепления нуклеазой микрококков, говорит о том, что область, непосредственно доступная для действия фермента, ограничена. К ней относится только часть каждого линкера. (Если бы вся линкерная ДНК была чувствительна, размер полосы колебался бы в интервале от 146 п.н. до отрезка, превышающего размер повторяющейся единицы). Но, после того как линкерная ДНК разрезана, оставшаяся часть становится чувствительной и довольно быстро расщепляется ферментом. [c.363]

Рис. 29.6. Нуклеаза микрококков ступенчато уменьшает длину ДНК нуклеосомных мономеров.

НМ—нуклеаза микрококков I -ДНКаза I II-ДНКаза II — точка симметрии [c.367]

Структура участка, в котором непосредственно происходит репликация ДНК, отличается от других областей. Этот участок более устойчив к нуклеазе микрококков и при ферментативном расщеплении образует полосы, отличающиеся по размеру от нуклеосомной ДНК. Следовательно, можно предположить, что в репликации ДНК участвует достаточно большой белковый комплекс, причем почти сразу после того, как он передвигается дальше, восстанавливается нуклеосомная структура. [c.370]

Единственная полоса соответствует фрагменту, отрезанному с одной стороны рестриктирую-щим ферментом,а с другой нуклеазой микрококков [c.377]

Рис. 30.1. Благодаря нуклеосомному фазированию сайты рестрикции попадают в уникальные положения линкерных участков, которые разрезаются нуклеазой микрококков.

Рассмотрим последовательность только для одной нуклеосомы. При расщеплении нуклеазой микрококков образуется мономерный фрагмент, состоящий из специфической последовательности. Если выделить ДНК и расщепить ее рестриктирующим ферментом, для которого имеется только один сайт рестрикции на этом фрагменте, то ДНК будет разрезана только в одной точке. При этом образуются два фрагмента, каждый с уникальным размером. Продукты двойного расщепления нуклеазой микрококков и рестриктирующим ферментом разделяют с помощью электрофореза в геле. Для идентификации фрагментов, образованных в результате двойного расщепления, используют специальный зонд, представляющий собой последовательность ДНК, непосредственно примыкающую к сайту рестрикции (с одной стороны). Этот метод называют непрямым концевым мечением (не совсем соответствующее название). [c.377]

Иначе говоря, идентификация одной четкой полосы показывает, что положение сайта рестрикции однозначно определено по отношению к концу нуклеосомной ДНК (который соответствует разрезу нуклеазой микрококков). Таким образом, нуклеосома обладает уникальной последовательностью ДНК. [c.377]

Отдельный мономерный фрагмент, полученный после расщепления нуклеазой микрококков, может быть представлен разнообразием последовательностей под действием рестриктирующего фермента этот фрагмент распадается, образуя непрерывную серию более мелких фрагментов. Если мы примем, что наименьший фрагмент, который можно идентифицировать методом гибридизации, содержит 20 пар нуклеотидов, то в описанном выше опыте мы получим размазанное пятно, содержащее фрагменты от 20 п.н. до полной длины мономерной ДНК. [c.377]

В большинстве случаев экспериментальные данные не получаются такими четкими, как в опыте, показанном на рис. 30.1 для однозначного расположения нуклеосом. Но иногда они достаточно сильно отличаются от широких полос или размазанных пятен, предполагаемых для случайной локализации. Из этих экспериментов действительно следует, что число сайтов разрезания нуклеазой микрококков ограничено немногими положениями по отношению к конкретным сайтам рестрикции. Следовательно, можно предположить, что образование нуклеосом ограничено таким способом, который позволяет им находиться только в немногих (2-4) альтернативных фазах. [c.378]

Специфичность нуклеазы микрококков [c.378]

Возможность такой ситуации выяснена с помощью контрольного эксперимента, в котором очищенную ДНК обрабатывали точно так же, как и хроматин. Если в определенном участке имеются места предпочтительного действия для нуклеазы микрококков, то должны образовываться специфические полосы. Затем полученную картину [c.378]

Если расположение нуклеосом на ДНК происходит случайным образом, то все сайты, чувствительные к нуклеазе микрококков, рано или поздно окажутся в линкерной области, став доступными для действия фермента. Картина расположения полос при расщеплении хроматина и ДНК будет одинаковой. Но, если нуклеосомы лежат в упорядоченных местах (фазированы), некоторые сайты, чувствительные к нуклеазе микрококков, будут вне пределов досягаемости, так как окажутся в пределах минимальной нуклеосомы. Тогда отдельные полосы, обнаруживаемые при электрофорезе расщепленной ДНК, будут отсутствовать в электрофореграммах расщепленного хроматина. Если же при образовании нуклеосом возникают новые чувствительные сайты, то в электрофореграммах расщепленного хроматина можно будет обнаружить новые полосы. Таким образом, различие в расположении полос при расщеплении контрольной ДНК и хроматина доказывает существование фазирования нуклеосом. Такие эксперименты действительно были выполнены. [c.379]

Нуклеосомная ДНК относительно нечувствительна к нуклеазе микрококков. Даже в изолированных частицах минимальной нуклеосомы только часть связей в ДНК оказывается чувствительной к ДНКазе I, делающей одноцепочечные разрывы (гл. 29). Напомним, что каждая нуклеосома существует не изолированно, а по соседству с другими, и рассмотрим два оборота ДНК, закрученные вокруг нуклеосомы. Все это выдвигает на первый план вопрос о том, имеет ли РНК-полимераза достаточный доступ к ДНК, если нуклеиновая кислота как обычно закручена вокруг нуклеосомы. Трудно себе представить, что в процессе транскрипции полимераза может следовать по ДНК вокруг нуклеосомы. [c.379]

Природа такого изменения непонятна. Такие воздействия, как разрезание хроматина под действием сил сдвига, могут уничтожить характерную реакцию на нуклеазу микрококков даже при сохранении нуклеосомной структуры. Таким образом, мы не можем сказать, исчезает ли лестница из-за того, что присутствие РНК-полимеразы (или других белков) затемняет картину, поскольку при этом нарушается высокая упорядоченность структуры, или оттого, что нуклеосомы видоизменяются или даже совсем исчезают. [c.380]

Рис. 30.6. До активации генов теплового шока в результате обработки нуклеазой микрококков возникает отчетливая лестница, которая становится смазанной после начала интенсивной транскрипции.

При расщеплении хроматина нуклеазой микрококков в том же самом эксперименте наблюдается другой эффект. В этом случае также обнаружено наличие защищенной области, но, кроме того, с обеих сторон от нее располагаются фазированные серии нуклеосом. Фазирование [c.392]

Эти синтетические достижения обеспечили возможность прямой идентификации 5 -дезоксинуклеотидов, образующихся в результате ферментативного гидролиза ДНК, который стал возможен в результате работ Клейна и Танхаузера [14]. Эти же исследователи определили структуры З -дезоксинуклеотидов, полученных из ДНК при ферментативном переваривании ДНК нуклеазой микрококков (23). Были синтезированы также 3, 5 -дифосфаты дезоксицити-Дина и дезокситимидина [24] и использованы для доказательства [c.39]

Нуклеаза микрококков РНК. одноцепочечная ДНК - -Ap Np---Up Np--- аналогично для дез-оксиряда Нуклеозид-З -фосфаты и динуклеотиды [c.72]

Относительная доступность некоторых гомодезоксиполинуклеотидов дает возможность получать соответствующие олигодезоксинуклеотиды их ферментативной деградацией. Для этой цели используют ДНК-азу I и нуклеазу микрококков (см. стр. 72). [c.101]

Рис. 29.4. Нуклеаза микрококков расщепляет ядерный хроматин на мультимерные серии отрезков ДНК, которые можно разделить с помощью электрофореза.

На основе такого анализа можно разделить нуклеосомную ДНК на две части. ДНК минимальной нуклеосомы имеет постоянную длину 146 п.н. и относительно устойчива к расщеплению нуклеазами. (Другие нуклеазы, в том числе и нуклеаза микрококков, останавливаются перед этим отрезком ДНК.) Линкерная ДНК заключает в себе остаток повторяющейся единицы. Ее длина может варьировать in vivo от такого малого размера, как 8 п. н., до такого большого, как 114 п.н., на 1 нуклеосому. [c.363]

В присутствии нуклеоплазмина гистоны могут связываться с ДНК, образуя в физиологических условиях (низкая концентрация соли) частицы. При расщеплении этих частиц нуклеазой микрококков образуются полосы ДНК размером в 146 и 165 п.н. Отсюда следует, что некоторые из образованных минимальных нуклеосом содержат дополнительную ДНК, протяженность которой недостаточ- [c.372]

Эти результаты проливают некоторый свет на природу межнуклеосомного сайта, разрезаемого нуклеазой микрококков. Вероятно, фермент разрезает линкерную ДНК не в наиболее открытой точке, а в предпочтительном сайте, ближайшем к этому положению (если такой есть). Поскольку положение таких сайтов может быть различным, ширина полос увеличивается. Способность сайтов предпочтительного расщепления привлекать к себе фермент, возможно, увеличивает количество положений в линкерной ДНК, наиболее доступных для нуклеазы микрококков. [c.379]

Другой подход к изучению этого вопроса заключается в расщеплении хроматина нуклеазой микрококков с последующим использованием зонда для определенного гена (или генов), чтобы установить наличие соответствующих фрагментов в обычной лестнице с шагом в 200 п.н. В таких экспериментах гены рРНК могут обнаруживаться во фракции нуклеосом. Однако всегда остается возможность, что эти определенные фрагменты происходят из некоторых нетранскрибируемых участков, тандемно входящих в исследуемый набор фрагментов. [c.380]

На примере некоторых генов теплового шока у D. melanogaster можно проиллюстрировать, что во время транскрипции в структуре нитей хроматина происходят определенные изменения. В период, предшествующий тепловому шоку, эти гены транскрибируются не слишком часто, а обработка нуклеазой микрококков приводит к появлению типичной лестницы (указывающей на нуклеосомную организацию соответствующих районов). После теплового шока они активируются и затем начинают интенсивно транскрибироваться. Как видно из рис. 30.6, лестница в результате оказывается довольно смазанной, что указывает на изменение нуклеосомной организации. [c.380]

Недолговечность ацетилированного состояния оказалась препятствием для его изучения. Однако это препятствие можно преодолеть, добавляя масляную кислоту к клеткам, растущим в культуре. При этом ингибируется фермент гистон-деацетилаза и ацетилиро ванные нуклеосомы накапливаются. Все гистоны сердцевины ацетилированы. При ацетилиро вании в хроматине происходят изменения, подобные тем, которые наблюдаются при активации гена. Такой хроматин более чувствителен к ДНКазе I и (возможно) к нуклеазе микрококков. Одна- [c.384]

Сайт на 5 -конце (3-глобинового гена взрослого типа у курицы предпочтительно расщепляется несколькими ферментами, включая ДНКазу I, ДНКазу II и нуклеазу микрококков. На карте, изображенной на рис. 30.18, показано, что сайты, предпочитаемые этими ферментами, лежат довольно близко друг от друга в пределах одной области. [c.390]

Особенно хорошо изучена чувствительная к нуклеазе область мини-хромосомы вируса SV40. Короткий сегмент около точки начала репликации, непосредственно предшествующий промотору для поздней единицы репликации, предпочтительно расщепляется ДНКазой I, нуклеазой микрококков и другими нуклеазами (в том числе рестриктирующими ферментами). По минимальной оценке область предпочтительного расщепления имеет в длину 400 п. н., причем этот фрагмент может быть вырезан в виде свободной ДНК. [c.391]

Что происходит с нуклеосомами, расположенными на конце хромосомы При расщеплении теломер инфузории Oxytri ha нуклеазой микрококков получается серия повторяющихся полос на расстояниях 100, 300, 500, 700, 900 п. п. от конца. [c.392]

Гираза связывается с субстратной ДНК, оборачивая ее вокруг тетрамерного белка. Фермент защищает примерно 140 пар оснований ДНК от переваривания нуклеазой микрококка (подобно защите, обеспечиваемой значительно меньшим по размеру гистоновым октамером). [c.413]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология