Хроматин расщепление

При расщеплении хроматина микро- [c.243]

Обработка микрококковой нуклеазой не единственный способ выявить в хроматине регулярное чередование защищенных участков (нуклеосом) и открытых участков (линкеров). Такая структура подтверждается и с помощью некоторых химических проб, которые модифицируют или расщепляют ДНК- Эти соединения расщепляют ДНК там, где она не связана с белками. Гистоны в составе нуклеосомы защищают ДНК, поэтому при ограниченном расщеплении получается характерная нуклеосомная лесенка. [c.244]

В период перед митозом (размножением) весь хроматин концентрируется в хромосомах. Хромосомы, состоящие из молекул ДНК, являются хранилищем информации о свойствах клетки и синтезе всех белков, необходимых ей в течение жизни, за исключением белков митохондрий. При почковании или делении весь генный аппарат клетки удваивается, каждая клетка получает полный набор хромосом и вместе с ним всю сумму информации, обеспечивающую ее рост и развитие. В период деления ядра ядрышковой субстанции не обнаруживается. У дрожжей при расщеплении хромосом не наблюдается ресорбции ядерных мембран (явление эндомитоза). Количество хромосом в ядрах дрожжей зависит от родовых особенностей. [c.29]

Рис. 29.2. Индивидуальные нуклеосомы высвобождаются в результате расщепления хроматина нуклеазой микрококков. Размер отрезка 100 нм.

Электрофорез образцов ДНК показан в нижней части рисунка. Каждая фракция образует полосу ДНК определенного размера. Отдельные полосы соответствуют определенным ступеням лестницы, полученной в результате расщепления хроматина. (Справа на фотографии представлена для сравнения лестница .) Нуклеосомы- [c.361]

Контроль расщеплен ия хроматина [c.362]

Если расположение нуклеосом на ДНК происходит случайным образом, то все сайты, чувствительные к нуклеазе микрококков, рано или поздно окажутся в линкерной области, став доступными для действия фермента. Картина расположения полос при расщеплении хроматина и ДНК будет одинаковой. Но, если нуклеосомы лежат в упорядоченных местах (фазированы), некоторые сайты, чувствительные к нуклеазе микрококков, будут вне пределов досягаемости, так как окажутся в пределах минимальной нуклеосомы. Тогда отдельные полосы, обнаруживаемые при электрофорезе расщепленной ДНК, будут отсутствовать в электрофореграммах расщепленного хроматина. Если же при образовании нуклеосом возникают новые чувствительные сайты, то в электрофореграммах расщепленного хроматина можно будет обнаружить новые полосы. Таким образом, различие в расположении полос при расщеплении контрольной ДНК и хроматина доказывает существование фазирования нуклеосом. Такие эксперименты действительно были выполнены. [c.379]

При расщеплении хроматина нуклеазой микрококков в том же самом эксперименте наблюдается другой эффект. В этом случае также обнаружено наличие защищенной области, но, кроме того, с обеих сторон от нее располагаются фазированные серии нуклеосом. Фазирование [c.392]

Клонированные фрагменты ядерной ДНК могут быть использованы в качестве радиоактивных зондов для изучения изменений в структуре хроматина, которыми сопровождается транскрипция соответствующих генов. Об изменениях в структуре хроматина в области интенсивно транскрибируемых последовательностей свидетельствует их повышенная чувствительность к расщеплению ДНКазой I. О способах обнаружения такого рода структурных изменений подробнее рассказывается в Дополнении 16.1. [c.220]

Недостатком метода является, однако, то, что и свободная ДНК расщепляется нуклеазами неравномерно, и в свободной ДНК есть точки предпочтительной первичной атаки нуклеазами, причем ни одна из известных пока нуклеаз не является исключением. Поэтому в опытах по гибридизационному картированию разрывов надо всегда тщательно сравнивать результаты, полученные на хроматине и на свободной ДНК- Иногда они совпадают, иногда — нет. Только в последнем случае можно делать вывод, что эти разрывы отражают организацию хроматина. Сейчас разработаны новые методы химического расщепления ДНК, которые менее чувствительны к ее структуре и могут быть использованы более успешно. [c.95]

РНК, белков определялось уровнем содержания предшественников, активностью РНК-полимераз, структурно-функциональным строением хроматина. Активность РНК-полимераз обнаруживалась уже на первом часу набухания семян. В дальнейшем ходе прорастания семян наблюдалось трехфазное изменение активности этих РНК-полимераз, которое коррелирует с трехфазным изменением биосинтеза РНК. Поэтому наблюдаемая нами периодичность активности ферментов, возможно, обусловлена интенсивностью процессов биосинтеза белков, в том числе и ферментов, и активностью протеолитических ферментов, осуществляющих гидролитическое расщепление белков в клетке. Оценки уровня интенсивности этих процессов можно производить с помощью определения величин V и V. . Отношение V /V. позволяет [c.165]

Присутствие фракции, устойчивой к нуклеазе, в хроматине, но не в чистой ДНК дает возможность предположить, что у марсианского микроорганизма ДНК входит в состав структур, подобных нуклеосомам, которые и защищают ее от микрококковой нуклеазы. Поскольку при жесткой обработке самый мелкий фрагмент состоит примерно из 300 нуклеотидов, то структура, подобная нуклеосоме, должна защищать фрагмент ДНК примерно такой длины. Образование шлейфа при разделении продуктов расщепления свидетельствует о том, что структуры, подобные нуклеосомам, у марсианского микроорганизма не расположены, как у земных организмов, на одинаковом расстоянии друг от друга. Если бы в марсианских клетках нуклеосомы располагались [c.389]

B. Обработка нуклеосом трипсином влияет на их особую популяцию, а именно на нуклеосомы из активного хроматина. Этот вывод сделан в результате сравнения нуклеосом, обработанных трипсином, с ДНК эритроцитов, обработанной ДНКазой I. При расщеплении микрококковой нуклеазой нуклеосом, обработанных трипсином, получается ДНК, которая защищает глобиновую к ДНК и ДНК эритроцитов (25 и 83% соответственно) в той же степени, в какой это делает ДНК эритроцитов, обработанная ДНКазой I, (25 и 78% соответственно) (табл. 9-1). [c.393]

Гистон Н1 существенно отличается от других гистонов. Он не входит в состав минимальных нуклеосом (см. раздел 4 этой главы) и участвует в организации 30-нм фибриллы хроматина. Его молекулярная масса превышает 20 ООО. Положительно заряженные аминокислотные остатки Н1, главным образом лизины, находятся в основном в С-конце молекулы и в меньшей степени в Ы-концевой части. Центральная область N-кoнцeвoй половины молекулы богата гидрофобными остатками и образует глобулу. Н1 обладает выраженной доменной структурой, мягкое расщепление трипсином легко делит его на глобулу и хвост . Помимо лизинов хвост богат остатками пролина и глицина и имеет неупорядоченную конформацию. [c.235]

Моно- и ОЛИ ногу клеосомы можно выделить, например, центрифугированием в градиенте сахарозы продуктов расщепления хроматина нуклеазой. Еще более тонкое фракционирование хро-матиновых частиц получают с помощью гель-электрофореза, при котором разделяются нуклеосомы с разной длиной линкера или различающиеся по белковому составу. [c.244]

Помимо гистона Н1 в организации соленоидной структуры хроматина участвуют, очевидно, и нуклеосомные гистоны. Положительно заряженные Ы-концевые области этих гистонов, как упоминалось ранее, несущественны для образования нуклеосомной структуры, но вовлечены в организацию соленоидной структуры Хроматина. Удаление этих участков с помощью мягкого расщепления гистонов трипсином в составе хроматина приводит к необратимому разворачиванию соленоида. [c.245]

Регуляторные ДНК-связывающие белки прокариот вызывают заметные изменения конформации ДНК. При рентгеноструктурном исследовании комплекса регуляторного белка TFIHA со своим участком ДНК оказалось, что двойная спираль находится в А-форме. Другие изменения (изгибы и изломы двойной спирали) можно обнаружить с помощью электронной микроскопии, электрофореза ДНК-белковых комплексов, а также при действии нуклеаз. Связанный белок защищает от расщепления 15—30 п. о. в месте связывания и порождает два участка повышенной чувствительности к нуклеазам с обеих сторон от места связывания. Тонкий анализ мест гиперчувствительности в хроматине эукариот показал, что они имеют точно такую же структуру — две гипер-чувствительные точки, разделенные защищенны.м участком. [c.257]

Рис. 126. Электрофорез фрагментов ДНК, образовавшихся при расщеплении микрококковой нуклеазой хроматина печени крысы (левая дорожка) и гриба неироспоры (правая дорожка)

Отделение гормон-рецепторного комплекса от хроматина. После освобождения гормон-рецепторного комплекса и его дефосфорилирования ядерными фосфопротеинфосфатазами происходит диссоциация комплекса на гормон и рецептор, последний перемещается в цитоплазму, ассоциируется с белками теплового шока и включается в следующий цикл передачи гормонального сигнала. Этот процесс называется рециклизацией гормонального рецептора. В некоторых случаях рециклизация не происходит, так как рецептор после поступления из ядра в цитоплазму подвергается протеолитическому расщеплению. [c.140]

Изучение кинетики расщепления хроматина нуклеазами и анализ смеси образующихся продуктов с помощью гель-электрофореза по-прежнему остаются основными подходами к выяснению структурной организации нуклеопротеидов ядер эукарио-. [c.193]

Б — электрофорез фрагментов ДНК, полученных путем расщепления хроматина эритроцитов цыпленка с помощью ДНКазы I, в пластинке 10%-ного полиакриламидного геля содержащего 40 мМ трис, 20 мМ NaOA , 2 мМ ЭДТА и 7М мочевину (pH 7,8). Ступенчатый характер полученной картины разделения обусловлен те.ч, что ДНКаза I расщепляет нуклеосомальную ДНК на фрагменты, различающиеся по длине на 10 нуклеотидных пар. (Дж. Аллан, неопубликованные результаты.) [c.194]

Лестница, полученная в результате обработки ДНКазой I, показана на рис. 29.13. Похожие результаты получают при аналогичной обработке хроматина. (Действительно, для таких экспериментов in vitro обычно используют препарат минимальных нуклеосом, так как трудно получить препараты полных нуклеосом с гомогенным распределением по размеру фрагментов ДНК.) Интервал между последовательными ступенями лестницы составляет примерно 10 оснований. Лестница вытягивается на всю длину ДНК минимальной нуклеосомы сайты расщепления пронумерованы от S1 до S13 (где S1 расположен через 10 оснований от меченого 5 -конца ДНК, S2-через 20 оснований и т. д.). Из этого следуют два важных вывода. Во-первых, ДНК не защищена на нуклеосоме и остается чувствительной к ДНКазе I она не покрыта белками. Во-вторых, чувствительные участки расположены периодически. [c.365]

Другой подход к изучению этого вопроса заключается в расщеплении хроматина нуклеазой микрококков с последующим использованием зонда для определенного гена (или генов), чтобы установить наличие соответствующих фрагментов в обычной лестнице с шагом в 200 п.н. В таких экспериментах гены рРНК могут обнаруживаться во фракции нуклеосом. Однако всегда остается возможность, что эти определенные фрагменты происходят из некоторых нетранскрибируемых участков, тандемно входящих в исследуемый набор фрагментов. [c.380]

При расщеплении хроматина ДНКазой I он деградирует в конце концов до кислоторастворимого материала (очень мелких фрагментов ДНК). За общим ходом реакции можно проследить, определяя долю ДНК, перешедшей в кислоторастворимую фракцию. За судьбой же отдельного гена можно проследить, исследуя количество нерасщепившейся ДНК по ее способности вступать в реакцию со специфическим зондом (для этого обычно используются метод рестрикционного расщепления, блоттинг и гибридизацию). Схема такого опыта приведена на рис. 30.7. Основной подход заключается в том, что потеря определенной полосы свидетельствует о том, что именно этот участок переварен ферментом. [c.381]

Оказывается, что расщепление до кислоторастворимого состояния только 10% общей ДНК приводит к исчезновению более 50% ДНК активных генов. Следовательно, можно предположить, что при таком расщеплении происходит преимущественная деградация активных генов. Исчезновение активных генов можно подтвердить прямым сравнением судьбы двух генов, активного и неактивного. На рис. 30.8 показано, что происходит с генами (3-глобина и с геном овальбумина в хроматине, выделенном из куриных эритроцитов (в этом хроматине гены глобинов экспрессируются, а ген овальбумина неактивен). Рестрикционные фрагменты, соответствующие генам (3-глобина, быстро теряются, тогда как фрагменты, представляющие ген овальбумина, расщепляются незначительно. (Ген овальбумина фактически деградирует с той же скоростью, что и вся ДНК, хотя это и не следует из показанного на рисунке анализа ранних стадий реакции методом блотт-гибридизации. Противоположная картина наблюдается в ткани яйцевода, в которой преимущественно деградирует ген овальбумина, тогда как глобиновые гены устойчивы, как весь остальной хроматин. Это коррели- [c.382]

Первый эффект, наблюдаемый при расщеплении хроматина очень низкой концентрацией ДНКазы,-это индукция разрывов в двухцепочечной ДНК в специфических сайтах. В случае целого генома, например у D. melanogaster, в результате воздействия образуется серия специфических фрагментов, варьирующих в размере от 2 до 20 т.п.н. Эти фрагменты соответствуют участкам ДНК, расположенным между сверхчувствительными сайтами. Такие фрагменты не образуются при расщеплении свободной ДНК они возникают (тканеспецифично) при расщеплении хроматиновой структуры. [c.388]

Подобные структурные изменения хроматина могут происходить у дрожжей в области центромеры. В данном случае кажется вероятным, что вместо видимого кинетохора сама нить хроматина вьшолняет функцию центромеры. Строение центромерной области было исследовано методом непрямого концевого мечения с использованием коротких фрагментов ДНК в качестве зОпдов. С помощью зондов были идентифицированы два сверхчувствительных к ДНКазе I сайта, локализованные с обеих сторон от областей I и III. Это короткие консервативные последовательности центромерной ДНК, приведенные на рис. 28.11. Область размером 220-250 п.н. между двумя сверхчувствительными сайтами защищена от нуклеазного расщепления. [c.392]

Рис. 16.11. Обнаружение участков хромати-новой ДНК, чувствительных к расщеплению ДНКазой I. Рестрикционный фрагмент, выявляемый по гибридизации с зондом 1, устойчив к ДНКазе I, вероятно, ввиду защитного действия структуры соответствующего участка хроматина. Напротив, другой рестрикционный фрагмент, гибридизующийся с зондом 2, чувствителен к действию ДНКазы I. С увеличением концентрации фермента в реакционной смеси количество соответствующего фрагмента убывает.

Требуются контроли специфичности, например блокирование альдегидных групп, расщепление ДНК Контрастирование хроматина, ядрышек и рибосом кроме того, раствор Б контрастирует миели-новую оболочку [c.102]

Апоптоз клеток в тимусе. 1. К долькам тимуса плода в тканевой культуре добавляли антитела анти-СОЗ, в результате чего при участии ТкР происходила активация клеток и включался механизм их запрограммированной гибели (апоптоз). На электронной микрофотографии видно, что в отличие от ядер нормальных клеток (Н), в которых хроматин диспергирован, в ядрах апоптотических клеток (А) наблюдается выраженная конденсация хроматина. (Фото любезно предоставлено д-ром С. Smith.) 2. Анализ ДНК апоптотических клеток методом электрофореза в агарозном геле видна характерная лесенка из фрагментов расщепленной ДНК. [c.224]

Чувствительность к действию нуклеаз. Судя по более высокой чувствительности к расщеплению под действием ДНКазы I или микрококковой нуклеазы, транскрипционно активные области хроматина упакованы менее плотно, чем области, содержащие неактивные гены. Такая чувствительность к нуклеа-зам часто распространяется на сегменты длиной несколько тысяч пар оснований, фланкирующие единицу транскрипции. Структурные особенности, лежащие в основе этой чувствительности, не установлены, но данные биохимических исследований свидетельствуют о том, что нуклеосомы, содержащие активные гены, характеризуются низким содержанием гистона Н1, обогащены ацетилирован- [c.137]

Кроме взаимодействия с ДНК гистоны также взаимодействуют друг с другом. Экстракцией 2 М Na l (а не кислотой) из хроматина выделен тетрамер, состоящий из двух молекул гистона НЗ и двух молекул гистона Н4. В этих же условиях гистоны Н2А и Н2В могут быть выделены вместе в виде димера. Современная модель структуры хроматина предполагает, что один тетрамер и два днмера взаимодействуют с 200 парами оснований ДНК, что составляет участок длиной - 70 нм. При этом образуется сферическая структура диаметром И нм. Считается, что хроматин представляет собой подвижную цепь, составленную из таких единиц. Эта предположительная модель подтверждается данными электронной микроскопии и методом дифракции рентгеновских лучей, а также расщеплением хроматина дезоксирибонуклеазой как в выделенных ядрах, так и в очищенных нитях хроматина (гл. 25). [c.232]

Pi . 9-7. Расщепление хроматина Ю марсианского микроорганизма шкрококковой нуклеазой (задача 9-9). Справа приведены результаты обработки хроматина из печени рысы. [c.135]

Вы выделяете хроматин из дрожжей дикого типа и из дрожжей, несущих отдельные плазмиды. Затем кратковременно обрабатываете эти препараты хроматина микрококковой нуклеазой, после чего депротеинизируете ДНК и обрабатываете ее нуклеазой BamHI, которая разрезает ДНК лишь в одном месте-в области центромеры (рис. 9-8). ДНК, обработанную таким образом, вы фракционируете с помощью гель-электрофореза и затем анализируете методом блот-гибридизации, используя в качестве зонда фрагмент радиоактивно меченной ДНК центромеры (рис. 9-8). Этот метод, называемый непрямое мечение концов , позволяет выявить все фрагменты ДНК, начиная с ДНК, расположенной непосредственно справа от участка расщепления ферментом BamHI. Контрольный опыт состоит в том, что вы депротеинизируете препарат хроматина, чтобы получить чистую ДНК, обраба- [c.135]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология