Гель-электрофорез определение молекулярного веса

Дальнейших успехов в химии гликонротеинов следовало ожидать на основе развития методов и лабораторной техники идентификации и количественного определения малых количеств сахаров и аминокислот, структурного анализа олиго- и полисахаридов, эффективного разделения и очистки белков, оценки гомогенности макромолекул и определения их молекулярных весов. С введением улучшенных методов исчерпывающего метилирования и периодатного окисления углеводов, реагентов (борогндридов щелочных металлов), избирательно восстанавливающих карбонильную группу, аналитической ультрацентрифуги Сведберга, аппарата Тизелиуса для электрофореза с подвижной границей, ультрафиолетовой и инфракрасной спектроскопии, метода меченых атомов, метода фракционирования белков плазмы крови холодным спиртом по Кону, хроматографии на бумаге и на колонках, хроматографии на ионообменниках, полученных из целлюлозы, упрощенных микрометодов электрофореза (электрофорез на бумаге, крахмальном или агаровом гелях), иммуноэлектрофореза и, наконец, последнего по времени, но важного в этой области открытия конститутивных и индуцируемых бактериальных ферментов, действующих избирательно на гетеросахариды, настало время для третьего и наиболее сложного и плодотворного периода исследования гликонротеинов. [c.18]

Пожалуй, самым ценным новым методом определения молекулярного веса является гель-электрофорез в присутствии денатурирующего [c.182]

Паркер и сотр. [72] в предварительных опытах показали, что восстановление и алкилирование дисульфидных связей в трансферрине по методу Крестфилда и сотр. [73] не вызывают диссоциации трансферрина на субъединицы. Это было доказано с помощью ультрацентрифугирования, методом седиментационного равновесия, с помощью гель-фильтрации на сефадексе Г-75, а также методом электрофореза на крахмальном геле в различных буферных системах (формиатный буфер pH 2,8, фосфатно-цитратный буфер pH 5,6 и боратный буфер pH 9,0) в присутствии мочевины. Кроме того, при определении N-концевых аминокислот в трансферрине динитрофениль-ным методом Сэнджера [74] и цианатным методом Старка и Смита [75] был обнаружен только один остаток валина при расчете на молекулярный вес 83 ООО, что согласуется с ранее опубликованной величиной молекулярного веса [76, 76а]. На основании описанных данных молекулу трансферрина можно представить в виде одной полипептидной цепи, содержащей примерно 750 аминокислот, и, следовательно, трансферрин является самым крупным из белков плазмы, который не был диссоциирован на субъединицы. [c.128]

Рис. 9. Калибровочная кривая для определения молекулярных весов методом электрофореза в пластинке полиакриламидного геля.

Значения молекулярных весов разных форм НАД-киназы, определенные методом гель фильтрации, совпадают с величинами, определенными методом электрофореза в градиенте концентрации ПААГ, за исключением низкомолекулярной формы НАД-ки- 230, назы с молекулярным весом 45000, которую при гель-фильтрации обнаружить не удавалось. [c.139]

При электрофорезе в полиакриламидном геле заряд белков не играет решающей роли в определении подвижности данной макромолекулы — особенно при электрофоретическом разделении кислых белков, обычно диспергированных в 0,1%-ном растворе додецилсульфата натрия. В этих условиях основные группы белка образуют комплексы с додецилсульфатом натрия и благодаря этому белки, подобно нуклеиновым кислотам, ведут себя главным образом как полианионы. Разделение в этом случае происходит в основном за счет различий в молекулярных весах, причем более мелкие компоненты движутся впереди более крупных. Путем стандартизации таких гелей с помощью белков или нуклеиновых кислот известного молекулярного веса можно с достаточной точностью определить молекулярный вес неизвестных компонентов [435]. Следует особо отметить, что если исследуемый белок состоит из двух или большего числа цепей, связанных друг с другом дисульфидными связями, и если разделение при этом проводят, как обычно, в присутствии сильных денатурирующих и восстанавливающих агентов, то полученные данные относятся к молекулярным весам структурных субъединиц или даже пептидных цепей. [c.62]

При электрофорезе в однородном геле очищенный фермент давал одну полосу, что указывало на его гомогенность. Молекулярный вес субъединицы, определенный в присутствии додецил-сульфата натрия, оказался также равным 45 000. Эти данные свидетельствуют о том, что в процессе ионообменной хроматографии разрушается четвертичная структура фермента, и в разной степени ассоциированные олигомеры распадаются на субъединицы. [c.140]

Этот метод составил сильную конкуренцию другим общеизвестным методам, что объясняется прекрасной разрешающей способностью геля в широком диапазоне молекулярных весов, а также тем, что величина молекулярного веса может быть установлена простым способом в течение одного дня и с малым количеством белка, требуемым для анализа. Метод ультрацентрифугирования, например, теоретически разработанный очень полно, требует использования специального дорогостоящего оборудования. Недостатком этого метода является большая или меньшая точность определения удельного парциального объема. Неопределенность в 0,02 мл/г в этом параметре (т. е. 2—3%) вводит погрешность до 10% в величину рассчитываемого молекулярного веса, даже если все центрифужные измерения, необходимые для расчета, были проделаны точно. В диапазоне молекулярных весов от 15000 до 100 000 точность определения молекулярного веса при электрофорезе в полиакриламидном геле с натрийдодецилсульфатом лучше 10%. Этот диапазон легко перекрывается большим числом белков-стандартов, имеющихся в продаже. Трудность с более высокими молекулярными весами происходит, видимо, оттого, что в диапазоне от 90000 до 200000 имеется слишком мало стандартных белков. Молекулярные веса полипептидных цепей обычно не превышают 100 ООО. [c.421]

КФ может диссоциировать на субъединицы только после обработки 05-Ка. При электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии 05-Ыа дифференцировали сперва три полосы, соответствующие трем субъединицам КФ, обозначенным а, р, у. Полоса, принадлежащая а-субъединице, была разделена на две а и а. Недавно Коэн и др. [49] обнаружили в молекуле КФ еще одну субъединицу — с м. в. 17 ООО — и показали, что по своим физикохимическим параметрам, первичной структуре [50], а также по функции она близка к кальмодулину — Са -связывающему белку, активирующему фосфодиэстеразу циклических нуклеотидов [М—53]. Ряд авторов проводил определение молекулярного веса субъединиц [20, 22, 23, 37, 38, 54]. Наибольшие колебания м. в. наблюдали для а- и р-субъединиц а — от 118 000 до 145 000, а — от 133 000 до 140 000, р — от 108 0000 до 130 000, V — от 41000 до 48 000. На основе определения молекулярных весов и их весовых соотношений рассчитывали стехиометрию субъединиц [20, 23]. Результаты, полученные разными методами исследования, [c.56]

Syne ho o us способен расти при температурах ниже оптимальной температуры роста, хотя и с меньшей скоростью. Электрофорез в геле клеточных белков, меченных с " С гидролизатом белка, из обработанных ХОЛОДОВЫМ и тепловым шоком клеток, обнаружил различия в уровнях синтеза ряда белков. Молекулярный вес индуцируемых холодом (10-22 0) полипептидов был определен как 74, 64.5, 23, 17 и 14.7 кДа. Изучение синтеза белков во времени показало прогрессирующую индукцию некоторых белков холодового шока ( SP) при 13 0. Тепловой шок вызвал немедленную репрессию синтеза большинства нешоковых белков. Результаты исследований показали, что фотосинтетическая активность и области критических температур у Syne ho o us зависят от температуры выращивания. Уменьшение потребления О2 колебалось в пределах изученной низкотемпературной области от 37% до 47%. Нри температуре [c.64]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология