Крахмальные гели

Рис. 3-6. Электрофоретическое разделение белков плгрмы человека пятью различными методами при pH 8. а — электрофорез без носителя б — электрофорез на бумаге в — электрофорез в крахмальном геле г — электрофорез в полиакриламидном геле д — иммуноэлектрофорез (полосы прештитации к поливалентной антисыворотке человека). Стрелки показывают положение отдельных белков плазмы.

Электрофорез применяют для очистки различных фармацевтических препаратов. В Фармакопее СССР (изд. 10) предусмотрено установление степени чистоты по электрофоретической однородности ряда антибиотиков, витаминов и других веществ. Электрофорез (ионофорез) является одним из методов введения лечебных препаратов в организм человека. Широкое применение как аналитический и препаративный метод разделения и выделения различных лекарственных веществ и биологически активных соединений нашел электрофорез на бумаге, а также в агаровом или крахмальном геле. Эти методы применяют также при диагностике ряда заболеваний путем сравнения фракционного состава (по числу и интенсивности зон на электрофореграмме) нормальных и патологических биологических жидкостей. [c.408]

При электрофорезе в поддерживающих средах наблюдается и электроосмос, влияющий на разделение белковых фракций, особенно если электрофорез проводить не на бумаге, а в агаровом или крахмальном геле. [c.191]

Различают свободный электрофорез и электрофорез в поддерживающих средах. При свободном электрофорезе изучаемую смесь белков помещают в буферный раствор, контактирующий с электродами. Установка для свободного электрофореза сложна она имеет фотооптическую систему для регистрации результатов разделения белковой смеси. Второй тип электрофореза предусматривает использование поддерживающих сред (специальной хроматографической бумаги, ацетатной целлюлозы, агарового или крахмального геля и т. п.), которые сначала пропитывают буферными растворами, а затем помещают на них исследуемую белковую смесь. Концы бумажных полос, агаровых или крахмальных блоков и т. п. контактируют обычно с буферным раствором, в который погружены электроды, соединенные с источником постоянного электрического тока (рис. 95 [c.218]

Диффузионные качества гелей, как об этом указывалось ранее (см. стр. 218), широко используются в лабораторной практике для электрофореза белков. Электрофорез в агаровом или крахмальном геле имеет определенные преимущества по сравнению с электрофорезом на бумаге, так как при этом выявляется большее количество и более четкое разделение белковых фракций как в нормальных, так и в патологических сыворотках крови. [c.240]

Электрофорезом в крахмальном геле удалось продемонстрировать, что альбумины пшеницы состоят, по крайней мере, из 21 компонента с разными свойствами. По своему аминокислотному составу они четко отличаются от проламинов и глютелинов. [c.181]

Электрофорез в крахмальном геле. Гель готовят из гидролизованного крахмала. Горячий гель заливают в кювету глубиной 5—6 мм, которую закрывают специальной крышкой, устроенной так, что в застывшем геле остается поперечный ряд узких щелей (0,3—0,7 мм). В щели вносят кусочки фильтровальной бумаги, смоченной раствором исследуемого вещества, и проводят одномерный или двумерный электрофорез в горизонтальных или вертикальных установках. Преимущество горизонтального варианта — простота исполнения, вертикального — большая разрешающая сила. [c.147]

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В КРАХМАЛЬНОМ ГЕЛЕ [c.12]

Некоторые методические сложности препятствуют широкому распространению электрофореза в крахмальном геле, несмотря на его весьма большую разрешающую способность. По сравнению с электрофорезом на бумаге электрофорез в крахмальном геле включает дополнительные операции, связанные с приготовлением и гидролизом крахмала, сборкой прибора, окрашиванием и количественным определением полученных фракций. Однако присущий крахмальному гелю эффект молекулярного сита увеличивает разрешающую способность данного метода по сравнению с электрофорезом на бумаге, и поэтому его используют для более тонкого анализа. [c.12]

Сравнительно новой разновидностью зонального электрофореза является электрофорез на ацетат-целлюлозной мембране [6]. Ацетат-целлюлозная мембрана, по-видимому,— очень хорошая поддерживающая среда, уже нашедшая благодаря ряду достоинств широкое применение. Выше мы отмечали, что приготовление крахмального и агарового гелей—довольно трудоемкая операция, осложняющая метод. В то же время способы предварительной обработки ацетат-целлюлозной мембраны почти так же просты, как и в случае с фильтровальной бумагой. При этом разделение белков происходит лучше и быстрее, а для анализа достаточно 5—1000 мкг белка, растворенного в объеме 0,1—10 мкл. Как белки, так и гликопротеиды очень хорошо окрашиваются на ацетат-целлюлозной мембране, поэтому она является прекрасной поддерживающей средой с точки зрения количественной оценки этих соединений. Электрофорез на ацетат-целлюлозной мембране позволяет получить больше белковых фракций сыворотки крови, чем электрофорез на бумаге, но меньше, чем электрофорез в крахмальном геле. С помощью электрофореза на ацетат-целлюлозной мембране можно определять весьма малые количества индивидуальных белков, благодаря чему он очень подходит для анализа гомогенности выделенного нативного белка. Ацетат-целлюлозные мембраны могут быть использованы также в опытах по иммунодиффузии, что является еще одним достоинством этого метода электрофореза. [c.14]

Принцип метода. Под влиянием электрического поля происходит миграция белков в крахмальном геле. [c.78]

X 20 X 250 мм. Буферный раствор заливают в резервуары 1 и 2, разделенные перегородкой из плексигласа на два отсека. В наружном отсеке каждого резервуара находятся угольные или платиновые электроды. Оба отсека в каждом резервуаре, а также буферный раствор и крахмальный гель соединяются между собой влажными полосками фильтровальной бумаги. [c.78]

Приготовление крахмального геля. Навеску картофельного крахмала суспендируют в 3 объемах воды, тщательно перемешивают и оставляют на 30 мин для отстаивания. Надосадочную жидкость. [c.78]

Внесение исследуемого образца. На расстоянии 7 см от катодного конца крахмального блока отмечают место внесения образца и в парафиновой пленке прорезают окошко размером 10 х 3 мм. Затем удаляют лежащий под парафином слой крахмального геля так, чтобы получился желобок, в который и вносится исследуемый материал. Очень удобно можно сделать этот желобок с помощью приспособления, изображенного на фиг. 8. Оно представляет собой стальную рамку с острыми краями 1, которую, надавливая, погружают в крахмальный гель попадающий при этом в ее внутреннюю полость кусочек геля удаляют. 0,05 мл сыворотки тщательно размешивают с сухим крахмалом, который берут в таком количестве, чтобы получилась однородная паста такой же консистенции, как и сам гель. При помощи плунжерной части 2 приспособления эту пасту вносят в желобок. Удалять рамку следует очень осторожно, стараясь не повредить целостность геля. После этого окошко в парафиновой пленке закрывают новым слоем расплавленного парафина. [c.79]

Электрофорез. Электрофорез в крахмальном геле продолжается 14—18 ч при градиенте напряжения 6 В/см. [c.80]

Элюирование белковых фракций. Используя окрашенный бумажный отпечаток, отмечают границы каждой фракции на крахмальном блоке. Острым лезвием по этим границам делят гель на фрагменты. Каждый фрагмент крахмального геля отдельно суспендируют в 10 мл холодной дистиллированной воды, частицы крахмала осаждают центрифугированием при 2000 об/мин и в надосадочной жидкости определяют содержание белка. [c.80]

ГОРИЗОНТАЛЬНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В КРАХМАЛЬНОМ ГЕЛЕ [c.80]

Приготовление крахмального геля. Берут такую навеску гидролизованного картофельного крахмала, чтобы конечная его концентрация составляла примерно 13—14%. Взвешенный крахмал суспендируют с размешиванием в 1/4 конечного объема буферного раствора. Остальной объем буферного раствора нагревают до кипения и затем охлаждают до тех пор (примерно до 96° С), пока не исчезнут пузырьки пара и воздуха. В горячий буферный раствор вливают суспензию крахмала и осторожно перемешивают, избегая образования пузырьков. Легче всего избавиться от пузырьков воздуха, поместив крахмальную суспензию в вакуум. Появление [c.80]

Полученный гель выливают в горизонтальную ванну, прикрытую стеклянной пластинкой. Эта ванна входит в комплект прибора для электрофореза. Гель должен полностью закрывать обеспечивающие электрический контакт фитили. Подготовку ванны с крахмальным гелем необходимо закончить в течение 3—5 мин. Примерно через час после этого в гель можно вносить исследуемый образец, как это описано в п. 4 разд. 1. [c.81]

Описанные выше методы электрофореза в крахмальном геле позволяют одновременно анализировать несколько белковых растворов (например, сразу несколько сывороток), если использовать более широкую ванну для геля. Например, в ванне шириной 124 мм можно одновременно параллельно фракционировать 8—10 сывороток. [c.81]

Толщина слоя крахмального геля не должна превышать 5— 10 мм. В более толстом слое геля миграция белков происходит неравномерно. [c.82]

Фиг. 9. Комбинация электрофореза в крахмальном геле с иммунодиффузией

Крахмал суспендируют в 270 мл буферного раствора, предназначенного для геля, в котором растворено 40,0 г мочевины. Все остальные процедуры проводят так же, как и при обычном горизонтальном электрофорезе в крахмальном геле (стр. 80). [c.83]

Глиадины характеризуются значительным полиморфизмом (см. главу 2). При кислой реакции среды можно обнаружить много компонентов. В крахмальном геле при pH 3,2 Отран и Бурде выявили [6] от 17 до 25 глиадиновых компонентов в зависимости от сорта пшеницы, а в целом у 73 французских сортов пшеницы — 43 компонента, различающихся своей электрофорети- [c.182]

Одним из наиболее распространенных методов фракционирования белков (как и методов оценки гомогенности) является диск-электрофорез (от англ. dis ontinuous-прерывистый, перемежающийся) в полиакриламидном геле, при котором используют пары буферных растворов с различными значениями pH и разной степени пористости гель. Следует отметить высокую разрешающую способность гель-электрофореза. Если при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге открываются всего 6 фракций, то при электрофорезе в крахмальном геле-10, а в полиакриламидном геле-до 18 разных белковых фракций. [c.31]

При электрофорезе в крахмальном геле фракция альбуминов у некоторых людей иногда делится на две (альбумин А и альбумин В), т.е. у таких людей имеется два независимых генетических локуса, контролирующих синтез альбуминов. Добавочная фракция (альбумин В) отличается от обычного сывороточного альбумина тем, что молекулы этого белка содержат два остатка дикарбоновых аминокислот или более, замещающих в полипептидной цепи обычного альбумина остатки тирозина или цистеина. Существуют и другие редкие варианты альбумина (альбумин Ридинг, альбумин Джент, альбумин Маки). Наследование полиморфизма альбуминов происходит по аутосомному кодоминантному типу и наблюдается в нескольких поколениях. [c.570]

Повышенная разрешающая способность электрофореза в крахмальном геле позволяет делить смесь белков на еще большее число компонентов. Вместо 5 классических фракций сыворотки можно получить 8—10 фракций. Более того, с помощью элекрофореза в крахмальном геле можно выделить несколько разных компонентов из препарата, который по данным других методов разделения считался гомогенным. Примеры такого рода встречаются при анализе миеломных белков. При электрофорезе на бумаге, ацетат-цел-люлозной мембране или в агаровом геле миеломные белки, относящиеся к IgG- и IgA-типам, образуют гомогенные зоны. Однако иногда в сыворотке больного можно обнаружить неоднородные фракции миеломных белков, например в случае мультиклональной миеломы или миеломы с агрегирующим белком IgA. Микрогетерогенность таких миеломных белков хорошо выявляется при электрофорезе в крахмальном геле. Вместо картины гомогенности, которую они дают при других постановках электрофореза, при разделении в крахмальном геле можно видеть несколько четко разграниченных зон [17]. [c.13]

Электрофорез в крахмальном геле имеет не только большое значение при диагностике парапротеинемий он весьма важен при определении гомогенности нативных белков и полезен при анализе субъединичной структуры молекулы белка. Например, папаиновые фрагменты IgG (Fab, F и F ) или выделенные из него полипептид-ные цепи (Н- и L-цепи) при электрофорезе в крахмальном геле образуют отдельные зоны. Это позволяет сравнивать субъединицы гомогенных IgG (миеломных белков или чистых антител) между собой. [c.13]

Фиг. 7. Прибор для электрофореза в крахмальном геле (по Смитису [26]).

В которую переходят из крахмала растворимые примеси, отбрасывают. Отмывание крахмала отстаиванием повторяют дважды, затем осадок переносят в воронку Бюхнера и 3—4 раза промывают буферным раствором. После этого делают пастоподобную смесь крахмала с буферным раствором и примерно 100 мл этой пасты переносят в коническую колбу емкостью 0,5 л. Постоянно размешивая, крахмальную пасту нагревают до получения абсолютно гомогенной массы, причем следует избегать кипения геля. Чтобы удалить пузырьки воздуха, в колбе, содер-жаш ей нагретый гомогенный крахмальный гель, с помош ью вакуумного насоса создают разрежение, и гель на 1—2 мин вскипает. После этого им заполняют ванну прибора для электрофореза избыток буферного раствора удаляют с помош ью толстой фильтровальной бумаги, а для того чтобы предотвратить испарение, поверхность геля заливают тонким слоем расплавленного парафина. [c.79]

Соединение внутренней электрической цепи прибора. Крахмальный гель в вертикально расположенной ванне и буферный раствор, заполняюш ий резервуары / и а также буферный и электродный отсеки в каждом резервуаре соединяются между собой бумажными мостиками. Каждый мостик состоит из 10 полосок фильтровальной бумаги, смоченной буферным раствором. [c.79]

Локализация белковых фракций. Закончив электрофорез, ъанну с крахмальным гелем извлекают из прибора и располагают горизонтально на столе. Пленку парафина, закрывающую гель, удаляют, и всю поверхность крахмала покрывают листом фильтровальной бумаги. Лист плотно прижимают к поверхности геля в течение 5 мин, затем снимают его, высушивают в сушильном шкафу при 100 С и окрашивают белковыми красителями (см. стр. 54). Этим способом удается установить локализацию фракций, не прибегая к окрашиванию самого крахмального геля (метод отпечатков), [c.80]

В нашей лаборатории горизонтальный электрофорез в крахмальном геле проводят по методу Смитиса [26] в камере для зонального полумикроэлектрофореза следующим образом. [c.80]

Фракции белка, разделившиеся в крахмальном геле, можно идентифицировать в реакции преципитации со специфической антисывороткой. Для этого Шёрлен и Голь [25] предложили комбинировать электрофорез в крахмальном геле с иммунодиффузией в агаровом геле. [c.82]

Методика. 1. Приготовление крахмального геля. В колбе на 1 л смешивают примерно 300 мл вероналового буферного раствора pH 8,6 (см. стр. 47) с равным объемом очищенного (не гидролизованного ) картофельного крахмала. Размешав, густую пасту выливают на плексигласовую пластинку с бортиком и оставляют на 10 мин. Фильтровальной бумагой удаляют избыток буферного раствора и затем поверхность крахмальной пасты разглаживают лопаточкой или другим подходящим инструментом. На одном конце готового блока вырезают желобок размером 1 х 9 см и в него вносят исследуемый раствор белков (например, 3 мл сыворотки крови), пред- [c.83]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология