Агаровый гель

Особенно чувствительными в процессе диффузии в агаровом геле получаются реакции преципитации при взаимодействии бел- [c.241]

Однако приготовление агарового геля является более трудоемкой процедурой, чем соответствующие операции с бумагой, о несомненно ограничивает широкое использование электрофореза в агаре. Другое затруднение связано с необходимостью подбора подходящего типа агара, так как качество агара влияет на электро- [c.13]

Кроме электрофореза на бумаге, п последнее время широкое распространение получили методы электрофоретического разделения веп еств на полиакриламидном, агаровом геле, крахмале и т. д. [c.38]

Принцип метода см. электрофорез на бумаге. В качестве поддерживающей среды используется агаровый гель. [c.74]

Она является главным компонентом агара и определяет в значительной мере способность этого замечательного вещества образовывать гель. Возможно образование твердого агарового геля, содержащего 99,5% воды. Молекулярная структура агарозы строится на основе левой двойной спирали, имеющей винтовую ось третьего порядка шаг спирали [c.120]

Электрофорез [79]. Для разделения можно использовать различие в скоростях движения ионов в электрическом поле. Следует различать явление простого электрофореза и электрофореза на носителе. Явление свободного электрофореза известно давно, но в последние 20 лет этот метод вытесняется методами электрофореза, проводимого на агаровом геле, крахмале, стекляН [c.386]

Так, при электрофорезе в агаровом геле интенсивность эндосмоса преобладает над электрофорезом и частицы многих крупных белков (Р2- и у-глобулинов), несмотря на то, что они имеют отрицательный заряд,, движутся к катоду. [c.191]

Микробиологи выращивают культуру микроорганизмов на агаровых средах. Практически это застывшая при комнатной температуре вода — твердый агаровый гель можно получить из 1 л воды и всего 1 г агара. При всей гигантской всеядности микроорганизмов в целом (некоторые из них разрушают бетон и резину, утилизируют молекулярный водород, живут в серной кислоте и т. д.) лишь немногие из них способны переваривать агар. Агар — тоже полисахарид. Его выделяют из морских водорослей, которым он и подобные ему полисахариды обеспечивают чрезвычайно прихотливый набор физико-ме-ханических и фи-зико-химических характеристик, необходимых растению для выживания в столь своеобразной среде, как прибойная зона Мирового океана. [c.5]

Опыты по гибридизации позволили исследовать гомологичность нуклеиновых кислот из разных источников. Вначале молекулы расщепляют (например, с помощью ультразвука) на фрагменты длиной 1000 нуклеотидов и подвергают денатурации. Фрагменты денатурированной ДНК смешивают с денатурированной ДНК из другого источника. Участки ДНК разных видов, имеющие близкие нуклеотидные последовательности, в той или иной степени гибридизуются, тогда как участки с сильно различающимися последовательностями гибридизации не поддаются. Рассмотрим один из вариантов постановки таких экспериментов. Денатурированную ДНК определенного организма, не подвергавшуюся деградации, заключают в агаровый гель [90] или наносят на нитроцеллюлозный фильтр [91]. Фрагменты ДНК из другого источника пропускают через колонку с ДНК-содержащим агаром или через фильтр с абсорбированной ДНК. Комплементарное спаривание соответствующих фрагментов задерживает их на колонке или фильтре, тогда как фрагменты, не нашедшие себе партнеров , свободно проходят дальше. [c.143]

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В АГАРОВОМ ГЕЛЕ [c.92]

В сыворотке крови здорового человека при электрофорезе на бумаге можно обнаружить 5 фракций альбумины, О -, а,-, 3-, у-глобулины. Методом электрофореза в агаровом геле в сыворотке крови выделяют 7— 8 фракций, а при электрофорезе в крахмальном или полиакриламидном геле—до 16—17 фракций. Следует помнить, что терминология белковых фракций, получаемых при различных видах электрофореза, еще окончательно не установилась. При изменении условий электрофореза, а также при электрофорезе в различных средах (например, в крахмальном или полиакриламидном геле) скорость миграции и, следовательно, порядок белковых зон могут меняться. [c.569]

Обработка агаровых пластинок. После окончания электрофореза ток выключают, предметные стекла с агаровым гелем тотчас извлекают из камеры и помещают на 30 мин в 5%-ный раствор СНзСООН. Каждую пластинку покрывают листочком фильтровальной бумаги, смоченным в 5%-ном растворе СНзСООН, для удаления воды и солей и высушивают при комнатной температуре в течение ночи. Для ускорения высушивания его проводят при температуре 37 °С или под струей теплого воздуха. Бумагу, приставшую к агаровой пленке, осторожно снимают, предварительно смочив ее водой. Перед окрашиванием агаровое поле должно быть совершенно сухим и прозрачным. Окрашивание белков на электрофореграммах проводят амидовым черным 10 Б в течение ночи. Не связавшийся с белком краситель отмывают 5%-ным раствором уксусной кислоты. Отмытые электрофореграммы высушивают при 37 °С. [c.93]

Метод зонального электрофореза имеет и некоторые недостатки. С его помощью нельзя произвести прямого определения скорости миграции белков. Между исследуемыми белками и поддерживающей средой возможны нежелательные взаимодействия, в результате которых часть белка адсорбируется в среде. Адсорбция происходит сильнее всего на бумаге, менее выражена на ацетат-целлю-лозной мембране и практически ничтожна в агаровом геле. [c.12]

Агаровый гель представляет собой очень удобную поддерживающую среду для зонального электрофореза, так как в 1—1,5%- ном агаровом геле белки мигрируют почти так же, как при свободном электрофорезе. По сравнению с бумажным агаровый электрофорез обеспечивает большую разрешающую способность и более быстрое фракционирование белков. Белки окрашиваются в агаре так же хорошо, как и на бумаге. Более того, прозрачность агарового слоя облегчает непосредственное фотоэлектрическое измерение белков. В агаре белковые фракции делятся весьма четко, без образования хвостов , что позволяет наносить большие количества белка, не снижая четкости разделения. [c.13]

Сравнительно новой разновидностью зонального электрофореза является электрофорез на ацетат-целлюлозной мембране [6]. Ацетат-целлюлозная мембрана, по-видимому,— очень хорошая поддерживающая среда, уже нашедшая благодаря ряду достоинств широкое применение. Выше мы отмечали, что приготовление крахмального и агарового гелей—довольно трудоемкая операция, осложняющая метод. В то же время способы предварительной обработки ацетат-целлюлозной мембраны почти так же просты, как и в случае с фильтровальной бумагой. При этом разделение белков происходит лучше и быстрее, а для анализа достаточно 5—1000 мкг белка, растворенного в объеме 0,1—10 мкл. Как белки, так и гликопротеиды очень хорошо окрашиваются на ацетат-целлюлозной мембране, поэтому она является прекрасной поддерживающей средой с точки зрения количественной оценки этих соединений. Электрофорез на ацетат-целлюлозной мембране позволяет получить больше белковых фракций сыворотки крови, чем электрофорез на бумаге, но меньше, чем электрофорез в крахмальном геле. С помощью электрофореза на ацетат-целлюлозной мембране можно определять весьма малые количества индивидуальных белков, благодаря чему он очень подходит для анализа гомогенности выделенного нативного белка. Ацетат-целлюлозные мембраны могут быть использованы также в опытах по иммунодиффузии, что является еще одним достоинством этого метода электрофореза. [c.14]

Если по окончании электрофоретического разделения белков в агаровом геле навстречу им диффундирует специфическая иммунная сыворотка, то в местах встречи антигена и антител образуются дугообразные полосы преципитации, каждая из которых соответ- [c.20]

Миграция белков в слое агарового геля подобна их движению при свободном электрофорезе. Однако в агаровом геле значительно сильнее, чем при электрофорезе на бумаге, выражен электроосмос, который усиливает поток буферного раствора в сторону катода. Чтобы устранить возможные артефакты, следует размещать лунки для внесения исследуемого образца точно в центре агаровой пластинки. [c.77]

Принцип метода. Растворимый антиген диффундирует в агаровом геле, содержаш ем иммунную сыворотку. В том участке геля, где возникает его относительный избыток, в агаре образуется полоса преципитации. [c.127]

Электрофорез сыворотки крови проводят в 1%-ном агаре в ме-динал-вероналовом буфере (pH 8,6) с ионной силой 0,05. Все белки сыворотки при pH 8,6 заряжаются отрицательно и перемещаются в электрическом ноле в сторону анода. Однако практически медленно продвигающиеся фракции белков сыворотки обычно движутся в сторону катода. Аномальное движение этих фракций объясняется наличием в агаровом геле электроэндоосмотического тока жидкости, направленного в описанных выше условиях от анода к катоду, а также тока жидкости, возникающего при неравномерном испарении воды с поверхности геля. Неравномерное испарение приводит к неравномерному распределению электрического поля в нем. Уменьшить испарение воды можно двумя способами 1) герметически закрывая электрофоретическую камеру во время электрофореза, 2) проводя электрофорез при низкой температуре (в холодильнике или холодной кОмнате, буферный раствор должен быть заранее охлажден). [c.92]

Через определенный промежуток времени антиген диффундирует в агар. В условиях относительного избытка антигена в агаре образуется полоса преципитации, которая медленно мигрирует от границы, разделяющей агар и раствор антигена, в нижние слои агара. Миграция полосы обусловлена диффузией антигена в агаровом геле, в результате которой постепенно увеличивается концентрация антигена между полосой преципитации и верхней границей агарового слоя, т. е. выше так называемого фронта преципитации. С увеличением концентрации антигена происходит не только продвижение фронта преципитации вниз, но также и растворение преципитата у верхнего края полосы. [c.128]

Принцип метода. Раствор белкового антигена и иммунная сыворотка диффундируют в агаровом геле навстречу друг другу и образуют преципитат. [c.129]

Принцип метода. Растворы антигена и иммунной сыворотки диффундируют навстречу друг другу в плоском слое агарового геля. В месте встречи антигена и антитела образуется преципитат. [c.131]

Набор штампов для вырезания лунок в агаровом геле. [c.131]

Приготовление лунок. Лунки в слое агарового геля для внесения исследуемых образцов можно сделать двумя способами [c.131]

А. Непосредственная фотопечать с агаровой пластинки. После образования полос преципитации поверхность агарового геля промывают дистиллированной водой и помещают препарат, подобно негативной фотопластинке, в фотоувеличитель. Далее поступают точно так же, как при обычной фотопечати. При помощи объектива фотоувеличителя полосы преципитации фокусируют на светочувствительной бумаге. Рекомендуется печатать на контрастной фотобумаге и использовать контрастный проявитель. [c.135]

Гранулированные гели. Разделение на гелях основано на распределении растворенных веществ между растворителем (подвижная фаза) и растворителем, содержащимся в порах геля (стационарная фаза). В отличие от распределительной хроматографии подвижная и стационарная фазы в этом случае одинаковы. Таким образом, распределение происходит на основе способности растворенных частиц проникать в поры разделение частиц определяется различной скоростью их диффузии. Сродство разделяемых веществ к гелю само по себе должно быть наименьшим во избежание побочных процессов. Для разделения гидрофильных веществ применяют гели на основе декстрана, полиакриламида или агаровый гель. Для разделения гидрофобных веществ необходимо применять гели, способные набухать в органических растворителях. Такие гели получают перезтерификацией гидроксильных групп декстранового геля. Этот способ можно применить для получения акриловых и полистироловых гелей, растворимых в жирах. [c.351]

Рис, 114, Определение идентичности 2 антигенов методом им-ыунодиффузив в агаровом геле [c.241]

Поддерживающей средой для электрофореза могут служить фильтровальная бумага, крахмальный или агаровый гели, аце-тат-целлюлозная мембрана, полиакриламидный гель и т. д. Создаваемое в смоченной буферным раствором поддерживающей среде электрическое поле заставляет различные компоненты смеси белков двигаться в определенном направлении со скоростью, соответствующей заряду молекул, что приводит к их разделению. Если электрофорез происходит в крахмальном или полиакриламидном геле, то разделение зависит не только от заряда, но и от величины и формы молекул, так как в этом случае поддерживающая среда выполняет роль молекулярного сита. При электрофорезе в щелочном буферном растворе белки сыворотки крови разделяются по меньшей мере на 5 фракций. При ионной силе 0,1 и pH 8—9 быстрее всех к аноду движется альбумин. За ним следуют в порядке уменьшения скорости миграции а-1-, а-2-, р- и 7-глобулиновые фракции. Подбирая соответствующую поддерживающую среду и буферный раствор, можно улучшить разделение. Поэтому даже в сравнительно малооснащенной больничной или клинической лаборатории зональный электрофорез позволяет проанализировать белки более детально, чем свободный. [c.10]

Подобно крахмальному и акриламидному агаровый гель является очень мягким носителем в отличие от электрофореза на бумаге при нем не происходит инактивации белков, что позволяет определять активность отдельных фракций бeлкОДJieпo peд твeннo в геле после проведения электрофореза. Приготовление агарового геля значительно проще, чем крахмального или полиакриламидного, продолжительность электрофореза составляет I—4 ч. [c.92]

Особо следует рассмотреть контакт между электродом сравнения и исследуемым раствором предпочтительны электроды с низким омическим сопротивлением электрического контакта. Необходимо избегать также загрязнения исследуемого раствора раствором из электрода сравнения (и наоборот). С этой целью обычно используют какой-либо солевой мостик с диафрагмой или без нее. Межфазный потенциал снижается, если используют соль, например КС1, с приблизительно равной подвижностью катиона и аниона. Для подавления диффузии между двумя лолуэлементами применяют разные диафрагмы, например насыщенный солью агар-агаровый гель, пористую стеклянную пластину, асбестовое волокно или пористую стеклянную мембрану. При этом возникает значительное омическое сопротивление, которое следует учитывать, подбирая внутреннее сопротивление прибора для измерения потенциала. В отдельных случаях необходимо использовать электрометр [174], но обычно применяют прибор типа рН-метра. [c.193]

Полное ферментативное расщепление белков проводят с помощью смеси ферментов, которую составляют протеазы, синтезируемые грибами (проназы). Однако ферменты смеси расщепляют еще и друг друга, так что в общем случае для количественного расщепления белка на составляющие его аминокислоты ферментативный гидролиз не годится. Один из новых методов основан на применении гидролитических ферментов, иммобилизованных на колонках с агаровым гелем. Гидролизуемый белок пропускают через гель, после чего на дне колонки скапливаются составляющие его аминокислоты [132]. [c.168]

Повышенная разрешающая способность электрофореза в крахмальном геле позволяет делить смесь белков на еще большее число компонентов. Вместо 5 классических фракций сыворотки можно получить 8—10 фракций. Более того, с помощью элекрофореза в крахмальном геле можно выделить несколько разных компонентов из препарата, который по данным других методов разделения считался гомогенным. Примеры такого рода встречаются при анализе миеломных белков. При электрофорезе на бумаге, ацетат-цел-люлозной мембране или в агаровом геле миеломные белки, относящиеся к IgG- и IgA-типам, образуют гомогенные зоны. Однако иногда в сыворотке больного можно обнаружить неоднородные фракции миеломных белков, например в случае мультиклональной миеломы или миеломы с агрегирующим белком IgA. Микрогетерогенность таких миеломных белков хорошо выявляется при электрофорезе в крахмальном геле. Вместо картины гомогенности, которую они дают при других постановках электрофореза, при разделении в крахмальном геле можно видеть несколько четко разграниченных зон [17]. [c.13]

В агаровом геле или на ацетат-целлюлозной мембране белковый антиген и специфические антитела диффундируют навстречу друг другу и образуют в месте контакта линии преципитации, которые можно видеть невооруженным глазом или выявить специальным окрашиванием. При анализе двух белковых смесей, например двух разных сывороток или выделенных нативных белков, с помощью этого метода можно не только узнать число индивидуальных белков, присутствующих в нашей системе, но и получить данные об их имму-нохимической идентичности, родственности или различиях. Все эти выводы могут быть сделаны на основании числа и взаимного расположения линий преципитации. [c.20]

Фракции белка, разделившиеся в крахмальном геле, можно идентифицировать в реакции преципитации со специфической антисывороткой. Для этого Шёрлен и Голь [25] предложили комбинировать электрофорез в крахмальном геле с иммунодиффузией в агаровом геле. [c.82]

Приготовление агарового геля. Перед использованием отмытого агара в нем определяют содержание сухого вещества. Для этого, тщательно взвесив чашку Петри, в нее наливают 10 мл расплавленного агара. После затвердения агар высушивают в сушильном шкафу при 100°С в течение примерно 12 ч. После охлаждения чашку Петри вновь взвешивают и вычисляют концентрацию агара в отмытом геле. (Если, например, чашка Петри до внесения 10 мл агара весила 50,0 г, а после высушивания в ней агара весит 50,5 г, то, следовательно, внесенный раствор агара имел концентрацию 5%.) Зная эту величину, отмытый агар расплавляют и 0,9%-ным раствором НаС1 доводят до нужной концентрации, прибавив в качестве консерванта 0,01 % мертиолата. [c.128]

Приготовление агаровой пластинки. Обычно реакцию ставят в плоском слое агарового геля, затвердевшего на дне чашки Петри. Сначала внутреннюю поверхность чашки Петри покрывают агаровой пленкой. Для этого ее наполняют 0,1 %-ным расплавленным агаром, затем сразу же агар выливают, а чашки переносят в эксикатор для полного высушивания. Другой вариант подобной процедуры состоит в том, что покрывают дно чашки Петри слоем 1%-ного расплавленного агара толщиной примерно 1 мм. В качестве консерванта в агар следует добавить мертиолат. [c.131]

В подготовленные чашки Петри наливают расплавленный в физиологическом растворе 1 %-ный агар, содержащий 0,1% мертиолата, таким образом, чтобы получился слой толщиной 3—4 мм. В приготовленном слое агарового геля делают лунки для внесения исследуемых образцов. [c.131]

Фиг. 23. Схема размещения исследуемых образцов в агаровом геле при постановке реакции преципитации по Ухтерлони [17] (подробное описание см. в тексте).

Фиг. 25. Схемы расположения луиок в агаровом геле.

Справочник химика 21

Химия и химическая технология