Кальмодулин

Первая стадия. На первой стадии реакции фосфодиэстераза гидролизует 3, 5 -цАМФ до АМФ (6). Реакцию проводят в инкубационной среде, состоящей из 50 мМ трис-НС1 (pH 7,0), 10 мМ ацетата магния, цАМФ как субстрата реакции (концентрацию цАМФ выбирают в зависимости от целей эксперимента) и 0,3—0,4 мкКи ( Н)-цАМФ для определения скорости реакции по изменению концентрации радиоактивного изотопа в пробе. Дополнительно в соответствии с поставленной задачей инкубационная среда может содержать ЭГТА для определения активности фосфодиэстеразы свободной от кальмодулина или Са + и кальмодулина для активации фермента, различные комбинации концентрации Са +, кальмодулина и его антагонистов для определения действия последних на комплексе Са +—КМ—ФДЭ. [c.381]

Рис. 7.9. Функции Са + внутри клетки. Пассивно входящий поток ионов кальция (б) вводится из цитоплазмы посредством активного транспорта через клеточную мембрану (а), через митохондрию (г), через саркоплазм этический ре-тику лум (б), выходящим током (а), сопряженным с входящим натриевым током, фиксируется кальмодулином и другими Са +-связывающими белками (е).

Фосфодиэстераза характеризуется наличием аллостерического центра, взаимодействующего с молекулой кальмодулина (КМ) в присутствии Са . Кальмодулин принято считать универсальным белковым модулятором. Число известных ферментов, подверженных его активирующему действию, довольно велико и продолжает расти. Показано, что кальмодулин, связывая Са +, претерпевает конформационные изменения, приобретая основное свойство — активировать фермент — мишень. Интегральная концентрация кальмодулина в клетке достаточно велика (1 —10 мкМ), поэтому его модулирующие свойства определены внутриклеточной концентрацией Са +. Взаимодействие Са +, кальмодулина и фосфодиэстеразы в первом приближении описывается следующей упрощенной схемой [c.378]

Цель работы — изучение регуляции фосфодиэстеразы циклических нуклеотидов из мозга крупного рогатого скота при действии кальмодулина. [c.379]

Измеряют активность фосфодиэстеразы в присутствии Са + и кальмодулина на профиле элюции фермента при повторной хроматографии на ДЭАЭ-ТСК. Фракцию с максимальной активностью отбирают для дальнейшего использования в экспериментах. Хранят при температуре -+-4°С. [c.382]

Кальмодулин — медиатор кальциевой регуляции [c.313]

Аксоплазматический транспорт является Са +-зависимым процессом. В нейронах, как, видимо, и в клетках других типов, найден белок, который участвует во многих процессах, регулируемых ионами кальция. Этот белок получил название кальмодулин [8]. Кальмодулин — очень устойчивый белок с М 17 00Ь, содержащий четыре Са +-связывающих центра в полипептидной цепи (рис. 10.6) его аминокислотная последовательность [c.313]

Избыточное количество цАМФ разрушается под действием фосфодиэстеразы. Имеются две формы этого фермента растворимая, активируемая ионами Са , и мембраносвязанная, каталитическое действие которой не связано с Са " . Для активации растворимой фосфодиэстеразы кроме ионов кальция необходим специальный кальций-связывающий белок — кальмодулин. Комплекс Са -кальмодулин присоединяется к фосфодиэстеразе и активирует ее [c.137]

Рис. 117. Фракционирование трипсиновых пептидов кальмодулина из мозга быка на колонке полистирольной анионообменной смолы Diaion DR-IO [Takahashi et al., 1981]

Молекула киназы фосфорилазы состоит из субъединиц четырех типов ар б. Молекулярная масса фермента — 1,3-10 Да — отвечает формуле (аРуб)4- Киназа фосфорилазы играет, как показано, ключевую роль в регуляции обмена гликогена и в сопряжении гликогенолиза и мышечного сокращения. В скелетной мускулатуре она существует в двух молекулярных формах нефосфорилированной ( неактивированная ) и фосфорилированной ( активированная ). Первая активна лищь при pH 8,2, вторая — при pH 6,8 и 8,2. При активации фермента отнощение активностей, измеренных при pH 6,8/8,2, возрастает от 0,05 до 0,9—1,0. Активация киназы достигается фосфорилированием а- и р-субъединиц, которое катализирует цАМФ-зависимая протеинкиназа. Каталитическую роль выполняет -субъединица б-субъединица идентична a +- вязывaющeмy белку — кальмодулину. Ферментативная активность киназы фосфорилазы полностью зависит от ионов На р-субъединице фермента имеется регуляторный центр, обладающий высоким сродством к АДФ. Константа Михаэлиса для АТФ равна [c.223]

Теоретическая направленность занятий в данном разделе практикума по биохимии связана с анализом основных высокоэффективных механизмов регуляции активности ферментов, обсуждаемых в настоящее время в учебной литературе и на страницах известных биохимических журналов. К таким механизмам относятся аллостерический механизм контроля активности, реализующийся на уровне существования множественных форм ферментов механизм усиления, связанный с функционированием субстратных циклов адсорбционный механизм контроля, реализующийся при обратимом взаимодействии ферментов с биологическими мембранами регуляторный механизм с участием вторичных мессенжеров (цАМФ, С +) и универсальных модуляторов белковой природы (кальмодулин). [c.329]

В отсутствие кальмодулина эффективная константа сродства фосфодиэстеразы к цАМФ>200 мкМ, к цГМФ>10 мкМ. [c.378]

Активация фосфодиэстеразы при действии комплекса Са +—КМ сопровождается увеличением величины Vmax от 3 до 50 раз и уменьшением эффективной константы сродства фермента к субстрату не более чем в 5 раз в зависимости от способа очистки и времени хранения фермента. Индуцированную комплексом активность фосфодиэстеразы ингибирует большое число различных по своей химической структуре соединений, известных под общим названием антагонисты кальмодулина (АКМ). К ним, в частности, относятся лекарственные препараты, широко применяемые в медицине. при лечении шизофрении, бронхиальной астмы, злокачественных опухолей и других заболеваний. Взаимодействие антагонистов кальмодулина возможно не только с каль-модулином, но и с фосфодиэстеразой, однако последний эффект обычно не учитывают, так как он появляется при значительно более высоких концентрациях антагонистов, чем первый. Действие этих веществ можно представить следующей упрощенной схемой [c.379]

Ионам Са принадлежит центральная роль в регуляции многих клеточных функций. Изменение концентрации внутриклеточного свободного Са является сигналом для активации или ингибирования ферментов, которые в свою очередь регулируют метаболизм, сократительную и секреторную активность, адгезию и клеточный рост. Источники Са могут быть внутри- и внеклеточными. В норме концентрация Са в цитозоле не превышает 10 М, и основными источниками его являются эндоплазмати-ческий ретикулум и митохондрии. Нейрогормональные сигналы приводят к резкому повышению концентрации Са (до 10 М), поступающего как извне через плазматическую мембрану (точнее, через потенциалзависимые и рецепторзависимые кальциевые каналы), так и из внутриклеточных источников. Одним из важнейших механизмов проведения гормонального сигнала в кальций—мессенджерной системе является запуск клеточных реакций (ответов) путем активирования специфической Са -кальмодулин-зависимой протеинкиназы. Регуляторной субъединицей этого фермента оказался Са -связывающий белок кальмодулин (мол. масса 17000). При повышении концентрации Са в клетке в ответ на поступающие сигналы специфическая протеинкиназа катализирует фосфорилирование множества внутриклеточных ферментов —мишеней, регулируя тем самым их активность. Показано, что в состав киназы фосфорилазы Ь, активируемой ионами Са , как и КО-синтазы, входит кальмодулин в качестве субъединицы. Кальмодулин является частью множества других Са -свя-зывающих белков. При повышении концентрации кальция связывание Са с кальмодулином сопровождается конформационными его изменениями, и в этой Са -связанной форме кальмодулин модулирует активность множества внутриклеточных белков (отсюда его название). [c.296]

Комплекс 4Са +—КМ—АКМ утрачивает свойство своего предшественника 4Са +—КМ и не активирует фосфодиэстеразу. Для значительной части антагонистов кальмодулина ингибирование сопровождается эффектом положительной кооперативности, что подтверждает гипотезу многоцентрового связывания этих соединений с комплексом Са +—КМ в процессе ингибирования индуцированной активности фермента. [c.379]

При работе с антагонистами кальмодулина важна последовательность добавления компонентов первого раствора 1) буфер, 2) кальмодулин, 3) антагонист, 4) фермент. После тщательного перемешивания раствор преинкубируют 10 мин, затем добавляют второй раствор, начиная тем самым реакцию (7). Во всех экспериментах объем первого раствора доводят буфером до 100 мкл. [c.381]

Исследуют влияние трифторниразина и его синтетического аналога W—7 на активность фосфодиэстеразы. В присутствии 50 и 100 нМ кальмодулина определяют зависимость скорости ферментативной реакции от антагонистов кальмодулина в диапазоне концентраций 10 — 10 М. Проводят оценку механизма действия антагонистов кальмодулина на фосфодиэстеразу [c.382]

Причиной высвобождения ацетилхолина является деполяризация нервного окончания в результате достигающего его потенциала действия. Однако в отсутствие ионов кальция во внеклеточном пространстве высвобождения медиатора не происходит. Мы уже упоминали, что ионы кальция влияют и на пороговую величину потенциала действия. Сейчас кажется очевидным, что они играют ключевую роль в химической синаптической передаче. Деполяризация нервного окончания увеличивает проницаемость мембраны для ионов кальция и, следовательно, их внутриклеточную концентрацию. Однако кальций, попадающий в нервное окончание, должен выделиться снова, если стимуляция Синапса временно прекращается. Имеются многочисленные доказательства того, что внутриклеточная концентрация кальция регулируется митохондриями и такими белками, как кальмодулин и кальциневрин (гл. 7). Митохондрии располагают очень эффективным кальциевым насосом, а ингибиторы митохондриальной функции вызывают, кроме того, количественное увеличение миниатюрного потенциала концевой пластинки, что также свидетельствует об ингибировании поглощения кальция митохондриями. Неясно, куда именно кальций переносится митохондриями с тем, чтобы они сами не перенасытились этими ионами. Еще меньше известно о молекулярном механизме кальциевой стимуляции высвобождения медиатора. Высказаны соображения о вкладе актомиозиниодобного комплекса, но экспериментальных доказательств этого еще нет. Зависимость кальциевого эффекта от его концентрации показывает, что несколько ионов (возможно, четыре) кооперативно активируют высвобождение кванта медиатора. Ионы Mg + конкурируют с [c.200]

Рис. 10.6. Кальмодулин. Молекула содержит четыре Са2+-связывающих домена а — первичная структура б — третичная структура [ВаЬи et at., Nature,

Са2+-кальмодулин выполняет регуляторные функции либо непосредственно как аллостерический регулятор отдельных белков, либо опосредованно через действие на Са2+-кальмодулинза-висимые протеинкиназы, которых особенно много в мозге (0,3% общего белка мозга). Наличие кальмодулина легко может быть подтверждено биохимическим анализом с использованием нейролептических препаратов, например хлорпромазина, который ингибирует действие Са +, опосредованное кальмодулином.. Целый ряд лекарств, включая некоторые местные анестетики, действуют аналогичным образом. При их применении в медицине остается неясным, сопровождается ли их терапевтическое действие побочными эффектами в нервной системе, а также там, где Са2+-кальмодулин играет основную роль in vivo. [c.314]

Сборка тубулина ингибируется ионами кальция при участии кальмодулина. Далее, кальмодулин играет специфическую роль при регуляции секреции нейромедиатора из нервного окончания— это также Са2+-зависимый процесс (гл. 8). Очень высокая концентрация кальмодулина в мозге (10 мкмоль/л), а также необычно высокая консервативность аминокислотной последовательности при эволюции указывают на значимость этого белка. Кроме участия в функционировании нейронов, кальмодулин работает как медиатор кальциевой регуляции аденилатциклазы, фосфодиэстеразы, фосфорилазы, киназы и фосфорилирования многочисленных мембранных белков. [c.314]

Из множества ферментов, регулируемых Са " , следует отметить протеинкиназы С, фосфорилирующие растворимые белки цитозоля, фосфодиэстеразы и аденилатциклазы, которые, в свою очередь, являются регуляторами процессов фосфорилирования белков. Связь Са с гормонами очевидна, так как при его дефиците действие гормонов прекращается. В приведенном выще примере фосфорилирования фосфорилазы b и перевода ее в активную форму существенную роль играет Са -кальмодулин. [c.138]

Проблема белка (1997) -- [ c.305 ]

Биологическая химия Изд.3 (1998) -- [ c.296 ]

Справочник биохимии (1991) -- [ c.288 ]

Нейрохимия Основы и принципы (1990) -- [ c.313 ]

Биохимия (2004) -- [ c.138 , c.252 ]

Молекулярная биология клетки Том5 (1987) -- [ c.47 , c.87 , c.102 , c.120 ]

Основы биохимии Т 1,2,3 (1985) -- [ c.794 , c.807 ]

Молекулярная биология клетки Т.3 Изд.2 (1994) -- [ c.375 ]

Биохимия человека Т.2 (1993) -- [ c.165 , c.167 , c.192 , c.193 , c.220 , c.335 , c.338 , c.339 , c.345 ]

Проблема белка Т.3 (1997) -- [ c.305 ]

Биохимия человека Том 2 (1993) -- [ c.165 , c.167 , c.192 , c.193 , c.220 , c.335 , c.338 , c.339 , c.345 ]

Биологические мембраны Структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами (2000) -- [ c.73 , c.76 , c.77 ]

Введение в биомембранологию (1990) -- [ c.83 , c.197 ]

Биохимия мембран Эндоцитоз и экзоцитоз (1987) -- [ c.74 , c.76 , c.77 , c.83 ]

Биохимия мембран Кальций и биологические мембраны (1990) -- [ c.9 , c.19 , c.43 , c.72 ]

Эволюция без отбора Автоэволюция формы и функции (1981) -- [ c.224 ]

Эволюция без отбора (1981) -- [ c.224 ]

Искусственные генетические системы Т.1 (2004) -- [ c.130 ]

Физиология растений (1989) -- [ c.248 , c.249 , c.326 ]

Структура и функции мембран (1988) -- [ c.111 ]

Молекулярная биология клетки Сборник задач (1994) -- [ c.228 , c.229 ]

Цитоскелет Архитектура и хореография клетки (1987) -- [ c.15 , c.31 , c.36 , c.59 , c.61 , c.77 , c.88 ]

Мышечные ткани (2001) -- [ c.211 ]

Молекулярная биология клетки Т.3 Изд.2 (1994) -- [ c.375 ]

Биологическая химия (2004) -- [ c.96 , c.216 , c.271 , c.422 , c.521 , c.525 ]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология