Молекулярный вес гель-фильтрации

Гели, молекулярные сита Гель-фильтрация, ситовая [c.48]

Диффузия в студнях лежит в основе гель-фильтрации — эффективного метода разделения молекул по их размеру. Этот метод позволяет отделять от макромолекул не только ионы солей, но и молекулы с низкой молекулярной массой. С помощью гель-фильтрации можно отделить полисахариды от моносахаридов, белки от аминокислот и других низкомолекулярных соединений. [c.268]

Фракционирование белков методом гель-фильтрации используется довольно редко, очевидно, ввиду низкой (по сравнению с другими хроматографическими методами) эффективности, присущей самому процессу (см. выше). Однако в тех случаях, когда число компонентов белковой смеси заведомо невелико, такое фракционирование может оказаться вполне эффективным приемом. Так, четыре главных белка вируса рака молочной железы мышей были успешно разделены по молекулярной массе методом гель-фильтрации их ком- [c.139]

В этом разделе были высказаны общие соображения и приведены примеры, относящиеся к очистке и фракционированию нативных белков. Полная денатурация белков производится при оценке их молекулярной массы методом гель-фильтрации. Особенности хроматографии денатурированных белков рассмотрены ниже, в соответствующем разделе. [c.141]

О двух последних столбцах речь пойдет ниже, а пока рассмотрим цифры, находящиеся в трех первых столбцах. Белки расположены в порядке увеличения объемов элюции (Уд) — соответственно увеличиваются и значения Следовало бы ожидать, что в этом же порядке будут уменьшаться молекулярные массы (М) белков, однако это не так. Фибриноген выходит из колонки первым, для него Kd = 0,03, т. е. намного меньше, чем для ферритина и уреазы, а между тем его молекулярная масса не больше, а меньше, чем у этих двух белков. Оставим в стороне ферритин — особый белок, в состав которого входит железо. Плотность ферритина р = 1,7, в то время как для подавляющего большинства нормальных белков р = 1,38. Но как объяснить несоответствие между значениями Kd и М для фибриногена и уреазы Kd фибриногена почти в 7 раз меньше, чем уреазы, а молекулярная масса его не больше, а в 1,5 раза меньше. Похоже на то, что основной закон гель-фильтрации ( чем меньше белок, тем больше Fr ) нарушается. [c.146]

Значения Rp известных белков мояшо использовать для построения калибровочного графика, с помощью которого можно затем оценивать молекулярные массы исследуемых препаратов (с теми же ограничениями, которые были указаны для гель-фильтрации па колонках). График следует строить в координатах log М и l/Rp, тогда в нем появится такой же линейный участок, как в графиках зависимости log М от Кяу. Действительно, [c.165]

При разделении нуклеиновых кислот используют те же методы, что и при фракционировании белков, однако имеются ограничения, обусловленные большим диапазоном величин молекулярной массы (2-10 —Ы0 ° Да), отклонениями от глобулярной формы, различиями в четвертичной структуре (двухнитевые, однонитевые, кольцевые), значительным отрицательным зарядом в нейтральной области pH. Поэтому методы гель-фильтрации и ионообменной хроматографии не получили широкого распространения при фракционировании нуклеиновых кислот и значительно уступают ультрацентрифугированию и электрофоретическому разделению в геле агарозы, полиакриламидном геле или их смеси. Поскольку величина отрицательного заряда нуклеиновых кислот и продуктов их расщепления мало зависит от pH, а отношение заряда к молекулярной массе сохраняется практически неизменным, разделение нуклеиновых кислот при электрофорезе определяется не их зарядом, а размером молекул. При наличии маркеров с известной молекулярной массой возможно определение молекулярной массы препаратов нуклеиновых кислот и их фрагментов. [c.171]

При определении молекулярной массы с помощью гель-фильтрации [70, 73] применяют сефадексы различного типа (0-50, 0-100, 0-150, 0-200), агарозы (сефарозы 2В, 4В, 6В) или полиакриламиды (биогели Р-100, Р-150, Р-300). Процесс проводят как в хроматографических колонках, так и на тонкослойных пластинках. Принцип метода уже рассматривался в разд. 3.3. [c.361]

Большое значение при доказательстве и определении молекулярной массы субъединиц имеют ультрацентрифугирование, ДСН-электрофорез в полиакриламиде, гель-фильтрация и другие уже рассмотренные ранее методы (разд. 3.5.4). В этой связи надо упомянуть, что в условиях диссоциации не только регуляторные, но и каталитические функции ферментов сильно повреждаются или совершенно теряются. [c.388]

Некоторые компоненты удалось получить в чистом виде и подробно проанализировать. Методами ионообменной хроматографии и гель-фильтрации был изолирован [80] альбумин с молекулярной массой 16 000 Да, который не имеет свободной SH-группы. Изолирован и другой альбумин [62] с молекулярной массой от 26 000 до 31 ООО Да, также не имеющий свободной SH-группы. Анализ аминокислот показывает, что соотношение (ионные-(-полярные) неполярные = 0,71, тогда как этот альбумин превосходно растворяется в воде. Отсюда автор [62] делает вывод, что структура этих белков стабилизируется гидрофобным ядром, а боковые полярные и ионные цепи преимущественно вынесены в наружную часть молекулы, т. е. в водную среду. [c.181]

Большинство авторов определило молекулярные массы а-глиадинов (табл. 6Б.4) в пределах от 27 000 до 38 000 Да [72, 73]. Этот диапазон может отражать определенную изменчивость молекулярной массы поскольку при использовании этого же метода в отношении нескольких а-глиадинов установлены [116, 114] разные молекулярные массы для каждого из них. Завышенные величины молекулярных масс для аг и аг-глиадинов, полученные гель-фильтрацией [147], объясняются тем, что исследования проводились в 0,1 М уксусной кислоте без предварительного восстановления дисульфидных связей и в отсутствие денатурирующего агента (мочевины или гуанидинхлорида), а также тем, что в этих условиях а-глиадины находятся не в форме статистического клубка. Ввиду этого результаты оказываются искаженными за счет конформации, которую принимают в этой среде а-глиадины и стандарты белков. Все а-глиадины образованы одной полипептидной цепью. [c.188]

Сочетая фракционное осаждение экстракта муки, солюбилизированной в 1,5 %-ном растворе ДДС-Na, с гель-фильтрацией на сефадексе G 100 или сефарозе L 4В, удалось выделить 7 фракций, которые различаются между собой молекулярными массами и степенью растворимости [84]. [c.200]

За последние годы широкое применение для разделения высокомолекулярных веществ и определения их молекулярной массы нашел предложенный Л. Поратом и П. Флодином метод гель-фильтрации (гель-хроматографии). Гель-хроматография состоит в фильтровании исследуемого раствора через колонки, заполненные зернами набухающего трехмерного полимера (сефадекса). Набухшие зерна сефадекса представляют собой своеобразные клетки , внутрь которых могут проникнуть путем диффузии только молекулы (ионы) подходящего размера. Более крупные молекулы проходят с фильтрационным потоком мимо зерен сефадекса (рис, 10.8). Набор различных марок сефадексов с возрастающим размером клеток позволяет отделять низкомолекулярньк вещества от высокомолекулярных, разделять макромолекулы, изучать образование ассоциатов в макромолекулярныхрастворах. [c.299]

A. Ахунову и Д. H. Сахибову (1963, 1970) удалось получить гомогенную протекназу из яда гюрзы, причем, на последней стадии очистки (сефадекс Г-75 и ДЕАЕ-целлвдлоза) фермент обладал активностью, в 18 раз превышающий активность протеиназ цельного яда. Молекулярный вес энзима при гель-фильтрации через сефадекс Г-100 35000—37000. Полученный фермент по своим свойствам близок к трипсину, причем подавление его активности ДФФ (5.10 Щ) указывает на важную роль серина в механизме действия энзима. [c.87]

В соответствии с определением, данным в статье (11, а], ири гель-фильтрации используют водные растворы и гидрофильные гели, а ири гель-ироникающей хроматографии — органические растворителп и гидрофобные гели. Фильтрование через гель применяется ири биохимических исследованиях и ири изучении природных соединений, гель-прони-кающая хроматография—для исследования синтетических высокомолекулярных соединений. Указанные методы включают также хроматографирование, или фильтрование , на молекулярных ситах [12]. Гель обычно характеризуют размерами молекул (точнее, интервалом молекулярных весов молекул), которые оп достаточно эффективно разделяет. [c.399]

Гель-фпльтрацию широко используют для определения молекулярных масс биополимеров, особенно белков. Чем меньше белок, тем больше объем элюции его с колонки (Fr) это, как мы видели,— основной закон гель-фильтрации. Графики селективности ясно указывают иа наличие линейной связи между логарифмом молекулярной массы белка (log М) и величиной Ка (или К ) в определенном интервале значений М для каждого типа геля. Казалось бы, задача этим решается. Достаточно определить в эксперименте значение для данного белка — и с помощью фирменного графика селективности можно будет найти log М, а следовательно, и М. Если довольствоваться весьма приближенным результатом, то можно так и поступить. Однако при более пристальном изучении этой проблемы с целью получить относптельно точные значения М она оказывается значительно слояшее. Прежде всего, фирменные графики селективности носят ориентировочный характер, и для разных партий одного и того же геля истинные зависимости log М от Кдч отличаются друг от друга. Это можно обойти, если построить самому такой график (калибровочную прямую) с помошью набора белков известной массы. Но тут-то и возникает главная трудность. Какие белки выбрать для такого построения Ответа на этот вопрос поищем сначала для случая нативньсх белков. [c.145]

Однако это не так. Дело в том, что под словом меньше мы не вправе подразумевать молекулярную массу белка, а должньс оценивать тот параметр, который действительно определяет возможность проникновения белка в поры геля,— его молекулярные размеры. Но если плотности всех нативных белков (за немногими исключениями) почти одинаковы, то их размеры, а точнее объемы, должны быть пропорциональны массам. Это верно, но остается еще один фактор, играющий в этом рассмотрении ключевую роль,— форма молекулы. Белковая глобула может быть почти шаром, а может напоминать палочку, поэтому ее поведение при гель-фильтрации (способность проникать в поры геля) будет совершенно различным в этнх двух случаях. Но можно ли составить представление о форме молекулы белка, если пе рассматривать ее (в нативном состоянии ) [c.146]

Отсюда следует вывод, что определение молекулярной массы нативиых белков с помощью гель-фильтрации, даже проведенное на уровне описанного выше современного подхода к этой задаче, может дать лишь приближенный результат. Тем более это справедливо в случае весьма распространенного упрощенного способа использования калибровочных кривых, построенных по молекулярным массам маркерных белков без учета их формы. То же относится к определению гель-фильтрацией молекулярных масс нативных нуклеиновых кислот с помощью маркерных НК известной массы, когда в число таких маркеров тРНК включают наряду с рибосомаль-пыми РНК, а нередко и фрагментами ДНК. Говорить же серьезно [c.150]

И тем не менее, в тех случаях, когда нужно хотя бы приближенно оценить молекулярную массу нативного белка, например состоящего из нескольких субъедпниц или полипептидных цепей, метод гель-фильтрации, даже в упрощенном варианте калибровки по массам, оказывается весьма полезным. Он позволяет выяснить, какое [c.150]

На трех соединенных последовательно колонках того же типа недавно удалось разделить сходные по молекулярной массе и заряду легкие цеии миозина после обработки его 4 М раствором мочевины. Элюцию вели 0,2 М К-фосфатным буфером в присутствии 2 М мочевины со скоростью 67 мл/см -ч разделение занимало 2,5 ч. Для такого же разделенпя гель-фильтрацией на агарозе требуется около 9 сут IWatabe et al., 1983]. [c.156]

Детерман T. ГЕЛЬ-ХРОМАТОГРАФИЯ. ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЯ. ГЕЛЬ-ПРОНИКАЮЩАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ СИТА. Пер. с нем.— М. Мир, 1970. [c.321]

В настоящее время имеется ряд новых методов определения молекулярного веса, которые могут соперничать с ультрацентрифугированием. Один из них — это простая гель-фильтрация. Колонку тщательно заполняют гелем (например, сефадексом) и калибруют, пропуская ряд белковых растворов. Измеряют Уе — объем элюата, собранного с момента нанесения вещества на колонку до момента его выхода из колонки, и делят этот объем на Уо — объем элюата для очень крупных частиц, совершенно не проникающих внутрь частиц геля. Далее строят зависимость Уе/Уо ОТ логарифма мол. веса для ряда белков с известным молекулярным весом. Как и при оценке молекулярных весов по константам седиментации, здесь предполагается, что молекулы всех белков имеют примерно сферическую форму для неизвестного белка значение молекулярного веса определяют по местоположению отвечающей ему точки на описанном выше графике [153, 154]. Модификацией этого метода служит хроматография при высоких концентрациях гуанидинхло-рида — соли, вызывающей денатурацию белков. Предполагается, что в таком растворителе белковая молекула представляет собой статистический клубок [154]. [c.182]

Гель-фильтрация позволяет грубо разделить глиадины на 2 группы с одной стороны, ш-глиадины и глиадины с высокой молекулярной массой (или растворимые глютенины) и, с другой стороны, а-, р- и 7-глиадины [40, 149]. [c.183]

Методом ДДС-Na-nAAr установлены [21] молекулярные массы 44 200 и 36 500 Да для субъединиц высокомолекулярных белков, присутствующих в спиртовых экстрактах белков, и молекулярные массы около 36 000 Да для а-, р- и 7-глиадинов. Используя гель-фильтрацию в диссоциирующей среде, Престон и Вудбери [161] в суммарном экстракте глиадинов обнаружили три фракции, которые по аминокислотному составу соответствуют глиадинам. Первая из них имеет молекулярную массу более 100 000 Да, а две другие — соответственно около 44 000 и 27 000 Да. [c.187]

Методом гель-фильтрации в 6М гуанидинхлориде после восстановления дисульфидных связей и алкилирования белков [91] для фракции глиадина III (а- и р-глиадины) установлена молекулярная масса 37 000 Да, а для фракции глиадина IV (а-глиа-дин) — молекулярная масса 30 000 Да. В каждой из этих фракций эти же авторы с помощью ДДС-Na-ПААГ выявили по 3 полипептида с молекулярной массой 33 000, 35 000 и 41 000 во фракции глиадина III и 29000, 31 000 и 34 000 во фракции глиадина IV [89]. [c.188]

Молекулярные массы р-глиадинов находятся в пределах от 27 000 до 41 000 Да [72, 73], хотя, по другим данным [171], большинство р-глиадинов имеют молекулярные массы между 30 000 и 35 000 Да (табл. 6Б.5). Результаты, полученные с помощью ДДС-Na-riAAr и гель-фильтрации, согласуются между собой, поскольку объемы элюции измеряли в среде ДДС-Na после восстановления дисульфидных связей и алкилирования р-глиадинов и стандартов. Выделенный Эвартом [72[ МТ р-глиа-дин четко отличается от других глиадинов более низкой молекулярной массой. [c.188]

Хюбнер и др. [98] разделяли глютенины после восстановления и алкилирования (Я -глютенины) гель-фильтрацией на сефадексе G 200 (0,03М уксусная кислота, 4М мочевина) на три фракции (А, В, С) равной величины, из которых первая (А) обнаружена в агрегированной форме. Две неагрегированные фракции (В, С) были повторно фракционированы ионообменной хроматографией на сульфоэтилцеллюлозе. В таких условиях фракция В разделяется на 7 фракций, из которых некоторые, хотя состоят из нескольких субъединиц с разными молекулярными массами, при электрофорезе в кислом pH ведут себя как гомогенные. Аналогичные результаты получены [89] при фракционировании на сефадексе G 100. Данно и др. [58] добивались аналогичного разделения путем. избирательного осаждения субъединиц этанолом. Для фракционирования субъединиц глютенинов используются также гель-фильтрация и ионообменная хроматография после избирательного растворения в уксусной кислоте [127]. [c.200]

Проведен анализ состава субъединиц глютенинов, выделенных с восстановлением или без восстановления дисульфидных мостиков. Посредством гель-фильтрации в диссоциирующей среде (5,5М ОиС1) из экстракта муки смесью УМЦ Хюбнер и Уолл [99] выделили две группы глютенинов одну в агрегированной форме с молекулярной массой свыше 5 млн., а другую с широким диапазоном молекулярных масс от 100 000 до 5 млн. Они не обнаружили различий между этими двумя группами в составе субъединиц. Однако более тщательное изучение очищенных глю- [c.202]

Частичный гидролиз полисахаридов позволяет выделить фрагменты с промежуточной молекулярной массой и разделить их с помощью таких хроматографических методов, как гель-фильтрация, ионообменная или распределительная хроматография. Строение этих более простых олигосахаридов установить легче, чем строение исходного полисахарида. Если все гликозидные связи в полисахариде гидролизуются с одной и той же скоростью (как, например, в линейных гомополисахаридах), то, например, в случае-амилозы продукт частичного гидролиза будет состоять из глюко.чы и ряда олигосахаридов — мальтозы, мальтотриозы и мальтотетра-озы. В гетерополисахаридах присутствуют гликозидные связи разных типов, и скорости гидролиза их различны. Фуранозиды обычно гидролизуются быстрее пиранозидов в 10—1000 раз, что приводит например, к удалению остатков арабинофуранозы, связанных с остатками ксилопиранозы в арабиноксиланах. Условия гидролиза влияют также на специфичность расщепления полисахарида. (1- 6)-Связи более устойчивы к действию минеральных кислот чем (1- 4)-связи, однако если гидролиз проводился в уксусном ангидриде, содержащем около 5 % серной кислоты, менее устойчивы (1-)-б)-связи. Параллельное использование этих двух методов гидролиза, приводящих к образованию фрагментов разного состава, позволит лучше воспроизвести строение полисахарида. Концентрация углеводов в реакционной смеси должна быть ниже [c.219]

Смотреть страницы где упоминается термин Молекулярный вес гель-фильтрации: [c.300] [c.70] [c.12] [c.175] [c.79] [c.693] [c.45] [c.102] [c.109] [c.112] [c.152] [c.155] [c.156] [c.156] [c.72] [c.84] [c.200] [c.202] [c.204] [c.102]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология