Карбоангидразы ферментативная активность

Причины потери ферментативной активности при замещении Си(П) наиболее четко вытекают из результатов Тейлора и Коле-мана [264]. Спектры ЭПР Си(П)-карбоангидразы согласуются с квадратно-плоскостной или тетрагонально-искаженной октаэдрической симметрией при координации азотсодержащих лигандов ионом u(II). К сожалению, на основании разностного синтеза Фурье в проекции [69] невозможно определить стереохимические изменения координируемых остатков при замещении u(II). Данные ЭПР по ориентированным кристаллам Си(И)-замещенной карбоангидразы отсутствуют, что не позволяет определить направление аксиальной симметрии центра координации u(II) относительно осей, фиксированных в молекуле. Если допустить (рис. 23), что три связи Си—N определяют плоскость комплекса u(II), образованную при сжатии обычной тетраэдрической структуры, положение молекулы растворителя, занимающей четвертое место в плоскости, не обязательно будет соответствовать тому же положению, что и в тетраэдрическом комплексе Zn(II). Более того, изменение геометрии координации при замещении ионом u(II) приведет к переупорядочению структуры воды в области активного центра, поскольку молекулы растворителя займут, вероятно, вакантные места в координационной сфере. Переупорядоченная структура растворителя по [c.105]

Кроме сведений о геометрии координации с помощью спектров поглощения в видимой области было получено много других полезных данных об активном центре. Это особенно относится к Со(И)-карбоангидразе, поскольку она обладает ферментативной активностью. Добавление сульфамидов или анионов, подобных цианиду, приводит к резкому увеличению интенсивности и уменьшению ширины полосы поглощения [20, 39, 73, 84] (рис. 16.5). Эти результаты были первым серьезным доказательством внедрения ингибиторов обоих типов в первую координационную сферу иона металла. [c.583]

Фермент карбоангидраза катализирует реакцию гидратации альдегидов, сложных эфиров, а также и двуокиси углерода. Для проявления ее ферментативной активности необходимо присутствие иона металла, например цинка. Реакцию гидратации пиридин-2-альдегида, катализируемую ионами цинка, можно считать моделью действия этого фермента. Константа скорости второго порядка этой реакции в 6,5-10 раз превышает константу скорости реакции с участием только воды [50]. Такое увеличение скорости реакции лишь в 10 раз уступает ускорению ферментативного процесса. Механизм модельной реакции включает, по-видимому, сближение цинка с реагируюш им центром, поскольку реакцию гидратации пиридип-4-альде-гида цинк катализирует в 280 раз менее эффективно. Реакция представляет собой, вероятно, атаку альдегида молекулой воды, входящей в гидратную оболочку иона цинка, или же ускорение реакции обусловлено поляризацией карбонильной группы ионом металла (как это показано, например, механизмами XXI и ХХП) [c.35]

Исследование функциональных и физико-химических аспектов взаимодействия ингибиторов с активным центром карбоангидразы способствовало разработке новых методов изучения фермента. Кинетические, спектральные и рентгеноструктурные данные о взаимодействии карбоангидразы с ингибиторами двух главных типов (сульфамидами и небольшими анионами) свидетельствуют о том, что их ферментативное связывание осуществляется одним и тем же центром белка [21, 101, 103]. Имеется достаточно оснований считать, что главную роль в этом взаимодействии играет обычная координация ионами металлов, хотя реальная картина явлений ингибирования может включать и другие типы взаимодействий [23]. [c.586]

Изофермент С (разд. 2) присутствует в эритроцитах человека и обезьяны в гораздо меньших количествах, чем изофермент В, однако первый намного активнее [47]. Удельная активность, выраженная в единицах, равных количеству фермента, необходимому для гидратации 1 мкмоля СОг в 1 мин при 25 °С, составляет 44 000 ед./мг белка для В-формы и 1300 000 ед./мг белка для С формы [47]. Последняя цифра соответствует числу оборотов 6-10 с- или 3,б>10 мин-. Это позволяет считать гидратацию СОг карбоангидразой самой быстрой из всех известных ферментативных реакций — факт, который нужно обязательно учитывать при сопоставлении гипотез о механизме действия (см. ниже). [c.613]

Молекула аконитазы содержит ион двухвалентного железа (Ре +), необходимый для проявления ферментативной активности. Хотя существует предположение о том, что ион железа может участвовать в окис-лительно-Еосстановительном процессе (протекающем по механизму, отличному от рассмотренного выше), более вероятно, что ион железа облегчает присоединение субстрата к ферменту и образование гидроксильного иона аналогично тому, как это было постулировано для иона 2п + в карбоангидразе (разд. 3,2) [120]. [c.150]

Изучение структуры. Как и при замещении 2п(П) в КПА, при взаимодействии ионов металлов с апокарбоангидразой наблюдается специфическое замещение иона 2п(П) на добавленный катион металла [260]. В табл. 11 суммированы данные по ферментативной активности металлокарбоангидраз и сродству к ингибитору — ацета-золамиду. Зависимость ферментативной активности и связывания специфического ингибитора карбоангидразы от природы катиона [c.101]

Очевидно, что структурные, спектроскопические и химические исследования не позволяют выявить аминокислотные остатки, ответственные за стабилизацию молекулы СОг при гидратации или аниона НСО"з в реакции дегидратации. Выяснение природы электронных перестроек, которые происходят в реакции карбоангидразы, представляет собой важную задачу дальнейших исследований этого фермента. Эдсал [245] отмечает, что причина, по которой неферментативная реакция гидратации СОг протекает значительно медленнее, чем реакция, катализируемая ферментом, заключается в том, что молекула СОг должна претерпевать значительную электронную перестройку при переходе из формы симметричной линейной молекулы с длиной связи С=0 116 пм к треугольному аниону НСОз с неэквивалентными связями С—О и с различными углами связей О —С —О. Структурные и спектроскопические исследования позволяют выяснить химическую природу некоторых групп в области активного центра, вовлекаемых в ферментативный катализ. Определение структурных основ стабилизации молекул субстратов СОг и НСОз" и промотирования ферментом электронной перестройки субстратов остается первостепенной задачей будущих исследований. [c.112]

Для выяснения механизма катализа оказались полезными исследования смещения кислотно-основных равновесий в ферментативной системе вследствие присоединения лигандов к свободным местам координационной сферы металла активного центра. При ингибировании ионами, подобными N или HS", в области значений pH, меньщих величины pH для диссоциации H N или HzS (при 23°С —9,3 или 6,9 соответственно [108]), должно наблюдаться выделение протонов. Общее количество последних будет зависеть уже от нового положения кислотно-основных равновесий системы. Для карбоангидразы исследавание этих явлений было проведено с помощью дифференциального титрования в интервале pH от 6 до 10 [86], т. е. в области устойчивости циа-нидного комплекса фермента. Метод заключался в фиксировании (на рН-стате с точностью 1 0,02 мкмоль Н+) выде.тения или поглощения протонов после прибавления к раствору фермента экви-молярного количества ингибитора, содержащегося в небольшом объеме его концентрированного раствора. [c.591]

В ферментативных реакциях самые убедительные доказательства участия механизма с координированным ионом гидроксила получены для карбоангидразы. По данным инфракрасной спектроскопии, молекула субстрата (СО2) не связана с атомом цинка, но расположена сравнительно близко от него, чтобы быть атакованной координированным гидроксильным ионом [82] (гл. 16, разд. 7). С этим механизмом согласуется зависимость активности от pH и природы разнообразных ингибиторов [ 114, 115]. Селвин [112] предложил похожий механизм для АТФ-азы митохондрий, участвующей в окислительном фосфорилировании. Он основывался на сходстве рН-зависимостей ферментативной реакции и упомянутого выще ускорения гидролиза АТФ ионами лантанидов. Однако величина р/Са для АТФ-азной реакции (примерно 7) была намного выще р/Са воды в комплексе с активирующими двухзарядными ионами. Для наилучщих активаторов М 2+, Со2+ и Ъг эта величина примерно равна соответственно 12, ---9 и 9 [87]. Селвин [112] предполагает, что кислотность комплексов может увеличиваться под влиянием положительно заряженных групп фермента, расположенных поблизости. Надо признать, что расхождение в 5 единиц pH для Mg2+ слишком велико, чтобы его можно было объяснить таким образом (необходимая для этого энергия электростатичеокого взаимодействия должна составлять примерно 7 ккал/моль). Выще говорилось о том, что ионизация свободной молекулы воды предложена в качестве объяснения перехода при pH 8,5, наблюдаемого для 2п +-содержащей щелочной фосфатазы. При этом увеличение pH приводило к уменьщению активности фермента. В силу этого можно считать, что механизм с координированным гидроксильным ионом вряд ли играет существенную роль при ферментативном гидролизе фосфатов. [c.651]