Разделение красителей методом электрофореза

Молекулы, разделенные с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, можно электрофоретически перенести на нитроцеллюлозную мембрану, с которой они свяжутся, воспроизведя картину элекрофоретического разделения. Этот процесс называют Вестерн-блоттингом или электроблоттингом [10, 17]. После блоттинга треки стандартного антигена и маркеров мол. массы окрашивают белковым или углеводным красителем, а остальные. инкубируют с образцами антител 9, 18]. С помощью меченых антител выявляют отдельные антигенные полосы (после электрофореза в. восстанавливающих условиях — субъединицы сложных молекул антигенов). Эту стадию называют иммунохимическим окрашиванием. В полном варианте метода используют как исключительную способность электрофореза в ПААГ разделять молекулы, концентрации которых очень малы, так и свойство антител выявлять специфические антигенные компоненты. Таким образом, метод чаще всего применяют для определения состава и молекулярных размеров антигенов, но, кроме того, он очень эффективен для определения специфичности антител (в частности, МКА) и поиска антигенно родственных молекул в однотипных или раз-лич.ных антигенных препаратах (например, различные виды бактерий, вирусные мутанты, клеточные экстракты и т. д.). [c.230]

Проведение электрофореза. Разделение можно проводить как в трубочках (с. 95), так и на пластинах для вертикального электрофореза (с. 97). После обработки ДСН к образцам добавляют сахарозу (до концентрации 10%) и в качестве лидирующего красителя — бромфеноловый синий (до концентрации 0,001%). Образцы исследуемых белков и белков-маркеров наносят на поверхность геля в объеме от 20 до 100 мкл (каждого или смеси нескольких образцов) и осторожно наслаивают электродный буфер. Нагрузка на гель определяется методом окраски гелей, а также способностью того или иного белка связывать используемый краситель. Как правило, при электрофорезе в трубочках удается обнаружить от 20 до 100 мкг белка, при электрофорезе в пластинке — от 4 до 15 мкг. В электродный буфер катодного отделения добавляют ДСН до концентрации 0,1%. Электрофоретическое разделение проводят при комнатной температуре и силе тока 8 мА на трубочку. При этом сначала устанавливают силу тока - [c.120]

РАЗДЕЛЕНИЕ КРАСИТЕЛЕЙ МЕТОДОМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА [c.35]

Высокоэффективным методом разделения является сочетание электрофореза на бумаге с обычной хроматографией. При этом сначала через влажную бумагу, на которую нанесена смесь, пропускают ток высокого напряжения, а затем смесь хроматографируют с помощью подходящего растворителя в направлении, перпендикулярном направлению электрофореза. В результате достигается разделение первоначальной смеси в двух измерениях. Применение такого метода к продуктам ферментативного расщепления белков позволяет получить двухмерную картину, которую называют пептидной картой. Каждый белок дает характерную для него при каждом конкретном способе расщепления картину. Локализацию отдельных компонентов во многих случаях определяют с помощью специфических красителей. При определении аминокислот и пептидов в качестве такого красителя используют, например, нингидрин. Если производится элюция адсорбированных компонентов, то удобнее всего устанавливать их присутствие в элюате спектрофотометрически. Вероятно, наиболее тонким методом разделения белков следует считать иммуноэлектрофорез, при котором эффект достигается за счет использования различий в двух свойствах электрофоретической подвижности и иммунологической специфичности. [c.220]

Описанные в настоящей главе методы можно использовать для обнаружения, а в некоторых случаях и для количественного определения белков после их разделения с помощью электрофореза в средах, содержащих обычные буферные растворы. В присутствии высоких концентраций таких добавочных агентов, как ДСН или мочевина, следует уделять особое внимание правильной фиксации белков. Амфолиты-носители, применяемые при изоэлектрофокусировании, создают дополнительные трудности, так как образуют со многими белковыми красителями нерастворимые комплексы. Поэтому при наличии в растворах указанных добавок необходимо применять модифицированные методы окрашивания. Некоторые примеры окрашивания белков после электрофореза в присутствии ДСН или амфолитов-носителей приведены в главах, посвященных соответствующим методам разделения. [c.278]

Другой вариант электрофоретического обесцвечивания основан на миграции молекул свободного красителя в направлении, перпендикулярном движению макромолекул при их разделении. Такой метод поперечного электрофореза обеспечивает быстрое удаление несвязанного красителя. [c.189]

Как уже упоминалось, в результате такого фракционирования получается сложная картина, насчитывающая иной раз более тысячи пятен. Она проявляется обычными методами — окрашиванием красителем СВВ R-250 или (в случае радиоактивных белков) авторадио- и флюорографией. После этого возникает нелегкая задача идентификации каждого пятна и сопоставления расположения пятен в различных опытах с учетом неизбежных отличий, вытекающих из невозможности абсолютно точного воспроизведения условий разделения, особенно при электрофорезе в формирующемся градиенте pH. Для решения этой задачи необходимо ввести какие-то системы отсчета, более надежные, чем простое измерение координат пятен. [c.56]

Электрофоретический метод анализа и разделения растворимых в воде промежуточных продуктов и красителей рекомендуется вести на бумаге (250—400 в и 3—6 ма) в 0,1—0,05 н. соляной кислоте (pH до 1,75), фосфатных и фосфатно-цитратных (pH 2,35— 8,7) и боратных буферах (pH до 9,7). В отдельных случаях электрофорез рекомендуется вести в 3%-ном водном аммиаке (pH 11,4). [c.277]

До сих пор не опубликовано ни одной работы, посвященной анализу этого класса красителей их анализ представляет собой пожалуй наиболее сложную и неблагодарную область работы для аналитика. Разумеется, разделение может быть произведено с помощью различных хроматографических методов, однако, кроме ответа на вопрос о цвете присутствующих красителей, хроматограмма не дает никакой полезной информации об их природе. Электрофорез позволяет получить некоторые сведения для классификации красителей — нейтральные, основные и кислотные красители могут быть идентифицированы по направлению их миграции. [c.497]

Выбор красителя и способа окрашивания зависит от состава изучаемого препарата, природы поддерживающей среды и в ряде случаев от метода разделения. Например, при фракционировании белков с помощью электрофореза в геле в присутствии ДСН или амфолитов-носителей к окрашиванию белков предъявляют особые требования. Эти вопросы будут рассмотрены в соответствующих главах, относящихся к отдельным конкретным методикам. [c.185]

Самым быстрым методом обесцвечивания фона является электрофоретическое удаление несвязанного красителя. В одном из его вариантов молекулы красителя перемещаются в том же направлении, в котором ранее двигались макромолекулы в процессе их разделения. Такое продольное обесцвечивание [281, 1034] проводят следующим образом. Окрашенные цилиндрические гели помещают в стеклянные трубки, внутренний диаметр которых несколько больше, чем диаметр самих гелей. Свободное пространство между гелем и стенкой трубки заполняют свежим гелеобразующим раствором. После его застывания трубки вставляют в обычный аппарат для диск-электрофореза и проводят электрофорез до тех пор, пока фон не станет светлым. Аналогичные результаты удается получить и без заключения окрашенного столбика в новый гель. Достаточно просто вставить его в стеклянную трубку, у которой дно затянуто диализной мембраной или закрыто пробкой из геля, а пространство между [c.188]

После электрофореза в агарозном геле, так же как после электрофореза в других гелях, разделенные компоненты обнаруживают путем окрашивания различными красителями или методами денситометрии в УФ-свете. Поскольку высушивание агаровых гелей не представляет трудности, в УФ-свете можно получать контактные отпечатки с высушенных пленок геля. [c.370]

Хроматография и электрофорез являются важными и удобными методами разделения смеси веществ с целью анализа и препаративной их очистки. Исключительное значение в контроле производства промежуточных продуктов и красителей приобрела жидкостная распределительная хроматография на бумаге, в колонках и в тонком слое на различных носителях (адсорбентах). [c.275]

Отчёт "Исследование однородное та и возможности аналитического разделения методой электрофореза миквобиолога-ческих красителей и гистологических реактивоз", П.Я. А-7815, 1971 г. [c.57]

Изоэлектрическое фокусирование в геле имеет определенные преимущества по сравнению с ИФ в среде со стабилизованным градиентом плотности. Эти преимущества состоят в следующем 1) сокращается длительность разделения 2) полностью подавляется термическая конвекция 3) применяется простое оборудование для ИФ 4) возможно одновременное разделение нескольких образцов 5) возможно обнаружение с помощью различных красителей и различных методик 6) возможно объединение ИФ и зонного электрофореза в двухмерном варианте 7) достаточно небольшого количества образца 8) возможно обнаружение белков методом иммунодиффузии. Однако при применении геля возникают проблемы, связанные с молекулярноситовым эффектом, который имеет место в основном при разделении больших молекул. Другой недостаток метода — это низкая точность определения pH в зонах. В настоящее время этот метод (сокращенное обозначение ИФПАА или ПАГИФ) является общепринятым и широко используется. В отдельных случаях, согласно данным [73], при проведении дискретного трубчатого электрофореза в полиакриламидном геле доо пска-ется окрашивание. Для снижения молекулярно-сито<вого эффекта рекомендуется [23] концентрация геля 3,7%. Типичный градиент напряжения для 8-часового разделения составляет 200 В на 60 мм. Если тепло отводится, то напряжение можно увеличить и соответственно сократить длительность разделения. Градиент pH можно измерить после разрезания столбиков с гелем и последующего элюирования сегментов небольшим коли- [c.323]

Повторное разделение одного и того же материала дает разные результаты. Причина плохой воспроизводимости может заключаться в изменении условий опыта. Чтобы сделать условия опыта стандартными а) необходимо помнить, что фильтровальная бумага должна быть одного и того же типа б) необходимо стандартизовать факторы, влияющие на электрофорез (направление потоков буферного раствора, температура и т. п.) (см. стр. 52) в) краситель должен быть одним и тем же г) не следует менять способа количественной оценки электрофореграмм. При использовании метода элюирования мы советуем окрашивать белки кислым фуксином. Несвязавшаяся с белком часть этого красителя легко удаляется из бумаги, а связавшийся краситель затем легко элюируется. С другой стороны, при фотоэлектрометрии электрофореграмм очень удобно применять окрашивание амидовым черным 10В, так как он прочнее других красителей связывается с белками и примерно в 10 раз сильнее поглощает свет. Несмотря на то что при отмывании электрофореграмм амидовый черный невозможно полностью удалить из бумаги, фотоэлектрические измерения после окрашивания этим красителем достаточно точны. [c.66]

Электрофорез на тонких слоях геля крахмала применяли для разделения белков сыворотки [191—193]. Для обнаружения фракций белка слои геля крахмала окрашивали красителем амидным черным 10 В. Обнаружение и идентификацию зон, разделенных электрофоретически, осуществляют методом иммуно-электрофореза. Корнгольд [194] использовал метод, при котором зоны, полученные электрофорезом геля крахмала, диффундировали в слои агара, где они реагировали с нанесенной антисывороткой. Для этого после завершения электрофоретического разделения слой крахмала подрезали лезвием бритвы и осторожно переносили на слой агарового 1,2 %-ного студня. По- [c.516]

Принцип метода сводится к электрофоретическому разделению на фракции предварительно окрашенных красителем Суданом черным липопротеинов сыворотки. Определение содержания (в %) отдельных фракций является диагностическим тестом при ряде заболеваний, например таких, как диабет, ожирение, атеросклероз, ишемическая болезнь и т. Д. Получаемые при электрофорезе липопротеинограммы специфичны для каждого заболевания. [c.154]

Теория и техника электрофореза на бумаге описаны в не--скольких монографиях [16, 124, 125]. Методы электрофоретического разделения основаны на различной подвижности заряженных частиц в электрическом поле. Из различных методов для исследования красителей наиболее приемлем электрофорез на бумаге. При анализе очень сложных смесей необходимо сочетание электрофореза с хроматографией. Для анализа красителей элек- [c.97]

Фракционирование нуклеиновых кислот путем электрофореза в агарозе — это наиболее удобный метод анализа как ДНК так и РНК. В данной главе изложен метод электрофоретического разделения ДНК, предварительно обработанной рестриктазами. Метод основан на том, что скорость миграции линейных молекул ДНК в электрическом поле пропорциональна их. длине. Таким образом, можно довольно легко разделить фрагменты ДНК разной длины, а также определить размер, сравнивая скорость их миграции в геле с маркерными ДНК известного размера. Полосы ДНК видны при освещении ультрафиолетом после окрашивания геля флуоресцирующим интеркали-рующим красителем бромистым этидием в низкой концентрации. Такой метод окрашивания обладает большой чувствительностью и позволяет обнаруживать зоны, содержащие всего [c.280]

После разделения белков на агаровом студне электрофорезом ван дер Хельм и Хольстер [189] определяли фракции экстракционным методом. Слои агара наносят на полоску из пластмассы, сушат фильтровальной бумагой н окрашивают 100 мл водного раствора 0,5 г красителя амидного черного, 5 г хлорида ртути, 5 мл уксусной кислоты. После 30-минутной обработки пленку промывают 5 %-ной уксусной кислотой и сушат. Затем полосы белков вырезают, элюируют 1 мл комплексона (500 мг/л) в 0,5 н. растворе гидроксида натрия. [c.516]

Аркел и др. [146] анализировали мукополисахариды микро-электрофоретическим методом Виеме [147, 148]. Поскольку поступающий в продажу агар загрязнен красителями, по модифицированной [149] методике Араки [150] получают агар, не содержащий сульфата (агарозу). Электрофорез проводят в 0,9 %-ной агарозе с использованием барбитуратного буферного раствора с pH 8,6 при напряженности 20 В/см. Электрофоретическое разделение завершается примерно через 7 мин. После этого тонкослойные пластинки погружают на час в 0,1 %-ный раствор цетавлона, чтобы осадить мукополисахариды. Чтобы условия осаждения были оптимальными, Аркел и сотрудники рекомендуют использовать цетавлон в физиологических солевых растворах. Зоны разделенных соединений обнаруживают, окрашивая пластинки толуидиновым синим. С этой целью 40 мг красителя растворяют в смеси 20 мл дистиллированной воды и 80 мл сухого ацетона. Пластинки выдерживают в этой смеси 15 мин, после чего ополаскивают 1 %-ным раствором уксусной кислоты до обесцвечивания фона. Эти же авторы описали другой метод окрашивания, а также метод окрашивания белков и мукополисахаридов. [c.574]

Электрофорез и электромиграцию можно использовать для разделения и идентификации микроколичеств материалов. Широкое использование этих методов, нанример в анализе аминокислот, белков, алкалоидов, красителей и их полупродуктов, сахаров и полисахаридов, хорошо известно. Применение этих методов в неорганическом анализе в некоторых случаях может иметь преимущество по сравнению с обычными методами. В этой связи может быть перспективным применение органических растворителей. Так, при электрофоретическом разделении в метанол — ацетонных смесях подвижность ионов резко отличается от подвижности в водных растворах, и Зг и Ва легко можно разделить, так же как отделить Zn от N1, Со и Мн [224]. [c.315]

В 34 главах изложены методы определения, выделения и очистки антител (включая дансилироваиие, двумерную хроматографию, изоэлектрофокусирование, электрофорез в полиакриламидном геле и изотахофорез) методы определения констант равновесия (равновесный диализ, равновесная фильтрация и седиментация) способы маркировки реагентов изотопами и флуоресцентными красителями и определение компонентов клеточной поверхности меры предосторожности при работе в изотопной лаборатории методы химической модификации белков, гаптенов и нерастворимых носителей приемы получения аитн-сывороток к аллотипам и антигенам гистосовместимости и получения антител доминирующего клонотипа методы оценки гистосовместимости и реакций в смешанной культуре лимфоцитов методы разделения клеток на гелях, несу- [c.7]