Антитела флуоресцирующие, определение

Пример 15-Х. Метод флуоресцирующих антител Антитело к определенному веществу (например, вирусному антигену или компоненту клеточной стенки) связывается с флуоресцирующим красителем. Если антитело инкубировать с клетками, содержа щими антиген, и затем отмыть, то при исследовании клеток с помощью флуоресцентной микроскопии флуоресценция будет наблюдаться только там, где присутствует антиген. Этот метод широко используется для обнаружения антигенов опухолей и для идентификации внутриклеточных вирусов. Более полное описание метода дано в гл. 2, а на рис. 2-20 приведен пример его использования. [c.446]

Л. а. используют в иммунохим. анализе для определения антител, гормонов, лек. препаратов, вирусных и бактериальных антигенов по концентрации комплекса антиген-антитело. При этом в иммунном флуоресцентном анализе к антителу непосредственно присоединяют флуоресцирующие в-ва, напр. РЗЭ, флуоресцирующие красители (чувствительность метода 10" моль/л), а в иммуноферментном анализе к антителу присоединяют фермент и в результате ферментативной р-ции, сопровождаемой биолюминесценцией, определяют ферментативную активность (чувствительность метода 10" моль/л). [c.614]

Существуют три основных методических подхода для решения этой задачи. Первый способ — избирательное окрашивание нейронов, выделяющих определенный нейромедиатор, может осуществляться с помощью преобразования естественного медиатора в его флуоресцирующее производное. В этом случае флуоресценция определенных групп клеток поможет выявить специфические связи в структурах мозга. Второй экспериментальный подход связан с введением молекул медиатора, предварительно меченного радиоактивным изотопом. Нейронные окончания, содержащие исследуемый медиатор, способны избирательно захватывать метку. Затем их легко выявить методом авторадиографии. Третий способ обнаружения специфических связей в нервной системе состоит в использовании высоко специфичной способности узнавать либо антигенные детерминанты медиатора, либо определенные ферментные белки, участвующие в метаболизме нейромедиаторов, либо нейрорецептор-ные компоненты на мембране клетки. Последние считаются наиболее убедительным свидетельством в пользу существования конкретных нейрохимических взаимодействий межцу клетками и зонами мозга. Обычно для иммунохимической идентификации используют флуоресцентный краситель или изотоп, который маркирует антитела. В последние годы широко распространились методы, использующие антитела, меченные частицами тяжелых металлов, например коллоидного золота, железа и др. [c.224]

Новые возможности для усовершенствования определения общего числа микроорганиз.мов открылись с развитием люминесцентного анализа. Метод флуоресцирующих антител нашел широкое применение в микро- [c.90]

Флуоресцирующие красители поглощают свет одной длины волны и излучают свет другой длины волны, более длинной. Если такое вещество облучить светом, длина волны которого совпадает с длиной волны света, поглощаемого красителем, и затем для анализа использовать фильтр, пропускающий свет с длиной волны, соответствующей свету, излучаемому красителем, флуоресцирующую молекулу можно выявить по свечению на темном поле. Высокая интенсивность излучаемого света является характерной особенностью таких молекул. Применение флуоресцирующих красителей для окраски клеток предполагает использование специального флуоресцентного микроскопа. Такой микроскоп похож на обычный световой микроскоп, но здесь свет от осветителя, излучаемый мощным источником, проходит через два набора фильтров - один для задержания света перед образцом и другой для фильтрации света, полученного от образна Первый фильтр выбран таким образом, что он пропускает свет длины волны, возбуждающей определенный флуоресцирующий краситель в то же время второй фильтр блокирует этот падающий свет и пропускает на окуляр свет длины волны, излучаемой красителем при его флуоресценции (рис. 4-6). Флуоресцентная микроскопия часто используется для выявления специфических белков или других молекул, которые становятся флуоресцирующими после ковалентного связывания с флуоресцирующими красителями. Например, флуоресцирующие красители могут быть связаны с молекулами антител, что сразу же превращает их в высокоспенифические и удобные красящие реагенты, селективно связывающиеся со специфическими макромолекулами на поверхности живой либо внутри фиксированной клетки (см. разд. 4.5.3). Для этой цели обычно используют два красителя - флуоресцеин, который дает интенсивную желто-зеленую флуоресценцию после возбуждения светло-голубым светом, и родамин, обусловливающий темно-красную флуоресценцию после возбуждения желто-зеленым светом (рис. 4-7). Применяя [c.177]

Неожиданная возможность изучать белки кинетохора у млекопитающих появилась, когда стало известно, что у больных некоторыми формами склерооермы (болезни неизвестной природы, связанной с прогрессирующим фиброзом соединительной ткани кожи и других органов), образуются антитела, специфически реагирующие с кинетохорами. Если такие антитела с флуоресцентной меткой использовать для окрашивания делящихся клеток, получается определенный рисунок флуоресцирующих пятен, каждое из которых отмечает положение кинетохора. Такой же пятнистый рисунок создается и в неделящихся клетках при этом число пятен в клетке соответствует числу ее хромосом (рис. 13-53), и можно думать, что какой-то предшественник кинетохора связан с каждой центромерой даже в интерфазном ядре. Антитела склеродермы сделали также возможным клонирование генов, кодирующих некоторые из [c.446]

Реакция гаптена с антителом может быть зарегистрирована с помощью техники спектрофлуорометрии. Как известно, флуоресценция триптофансодержащих белков обусловлена почти исключительно индольными остатками триптофана. Последние, находясь в неполярном микроокружении, флуоресцируют с максимумом при 330 нм в случае облучения белка ультрафиолетом с длиной волны 270—290 нм. Если в активном центре антитела находится гаптен, одна из полос в спектре поглощения которого совпадает с полосой поглощения триптофана, происходит тушение флуоресценции триптофана, содержащегося в молекуле антитела, а следовательно, флуоресценции собственно молекулы антитела (5. УеИск е1 а ., 1963). Такой феномен наблюдается при взаимодействии нитрофенильных гаптенов с направленными к ним антителами. Степень тушения достигает 70% для нерасщепленного антитела и 907о для его РаЬ-фрагмента. Чувствительность метода при использовании чистых антител очень велика на одно определение достаточно 50 иг антител. [c.248]

Главным инструментом при изучении антигенов клеточных мембран служат флуоресцирующие антитела. Соответствующий метод, впервые разработанный Кунсом и его сотрудниками еще в 1941 г. (обзор СоМтап, 1968), состоит в применении аитител, конъюгированных с флуорохромами, для определения точной локализации специфических антигенов на срезах ткаией или мазках. Этот метод, сочетающий гистохимические и иммунохимические подходы, благодаря своей универсальности, специфичности и простоте занял важное место в клеточной биологии. Чувствительность окрашивания можно повысить, если ис-пользовать непрямой метод. Прн этом немодифициро-ваниую специфическую антисыворотку наносят на исследуемый образец, и антитела соединяются с антигеном. Затем образец отмывают от избытка антисыворотки и обрабаты1вают меченными флуоресцеином антителами к иммуноглобулинам того вида животных, от которого была получена первая антисыворотка. [c.161]

Для выявления какого-либо поверхностного клеточного антигена нужно иметь специфичные к нему антитела и метод, позволяющий подсчитать, какое число клеток в данной популяции связывает эти антитела. Приготовление антисывороток к поверхностным клеточным антигенам подробно описано в гл. 13. Существуют два основных способа выявления клеток, несущих такие антигены. Один из них состоит в том, что антисыворотку обрабатывают флуорохромом, и в результате этого соответствующие клетки флуоресцируют в ультрафиолете (см. гл. 9). Вместо этого можно обрабатывать клеточную популяцию антисывороткой и комплементом при этом клетки, связавшие антитела, погибают, и их можно обнаружить с помощью витального красителя, например трипанового синего. В настоящей главе описан метод определения поверхностных клеточных антигенов, в котором клетки, связавшие антитела, выявляются с помощью особым образом обработанных бараньих эритроцитов (БЭ). Преимущество этого метода состоит в том, что, обладая высокой чувствительностью, он позволяет достаточно быстро исследовать большое число клеток антитела при этом используются в немодифи- [c.273]

Авторы одной из работ (Neurath, Stri k, 1981) сообщают о том, что замена хромогенного субстрата на флуорогенный позволяет повысить чувствительность определения -галактозидазы на три порядка. Теоретически это должно означать, что применение флуориметрии вместо колориметрии при проведении ИФА с использованием -галактозидазы в качестве индикаторного фермента может в тысячу раз снизить предел обнаружения антигена. В действительности несмотря на то, что флуориметрический вариант ИФА, который авторы использовали для обнаружения поверхностного антигена вируса гепатита В человека, был примерно на два порядка более чувствительным, чем РИА, им не удалось достичь предельной чувствительности, предсказанной на основании данных по предельной чувствительности определения самого фермента. Оказалось, что чувствительность ограничивается фоновой флуоресценцией, наблюдаемой для образцов, не содержащих антигена. Фоновая флуоресценция может быть вызвана неспецифическим связыванием использованных антител. В таком случае повышения чувствительности можно достичь, только повышая специфичность собственно иммунохимических компонентов системы. Другое возможное объяснение связывает фоновую флуоресценцию с присутствием в реакционной смеси флуоресцирующих примесей. В этом случае следует использовать более чистые реагенты и (или) проводить окончательные измерения флуорес- [c.289]

Быстрый прогресс клеточн й тммуиологии был связан с использованием иммунологических методов. Особую роль сыграло применение меченых антител, каждое из которых реагирует с одним из вариантов Н-или Ь цепей или с каким-либо иным антигеном. Пометив такое антитело радиоактивным соединением (например, Н, 1) или флуоресцирующим красителем и обработав ими пр параты (ма ки или срезы) лимфатических кл ток, можно с потной определенностью выявить клетки, с кретирующпе ти содержащие на поверхности тот ти инои антиген, например антиген ц-цепи имм н поб>л ш в. [c.6]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология