Определение белка в ферментных препаратах

Представляя для печати результаты, полученные при определении чистоты ферментного препарата с помощью гель-электрофореза, важно дать какую-то количественную оценку содержания всех присутствующих в нем примесей. Заявление, что образец дал одну полосу при электрофорезе , неубедительно, если количество нанесенного на гель белка было настолько мало, что получилась только одна слабо окрашенная зона. Желательно также представить какое-то подтверждение того, что окрашенная полоса — это действительно данный фермент, а не присутствующий в препарате другой белок, который в количественном отношении даже превосходит исследуемый фермент. В литературе часто встречаются примеры того, как совершенно ошибочно основная полоса, полученная при электрофорезе, без всяких доказательств приписывается очищенному ферменту, хотя на самом деле она относится к примеси. Если удельная активность выделенного препарата слишком низка, то количество данного фермента в нем может составлять всего лишь 1% общего содержания белка, и при гель-электрофорезе его вряд ли можно заметить. В этом случае могут помочь фотографии электрофореграмм, хотя на них обычно плохо воспроизводится картина распределения окраски по относительной интенсивности. Более надежные в этом смысле результаты дает сканирование окрашенного геля (рис. 9.7). При этом единственная оговорка, которую можно сделать, касается относительной интенсивности специфической окраски различных обнаруженных компонентов. Исходя из предположения, что все белки окрашиваются одинаково, можно произвести точное количественное определение всех компонентов, используя гель-сканирующее устройство. [c.329]

Определение белка в ферментных препаратах [c.29]

Исследования А. Н. Белозерского и А. С. Спирина с бактериями показали, что наряду с общим несоответствием нуклеотидного состава РНК и ДНК имеется вполне определенная положительная корреляция состава суммарной РНК клетки с составом ДНК, хотя изменение состава РНК в зависимости от состава ДНК оказалось очень малым. Эти исследования позволили Белозерскому и Спирину еще в 1957 г. предположить, что некоторая часть РНК клетки может в полной мере коррелировать по своему составу с составом ДНК, а в 1959—1960 гг. они установили, что часть РНК, коррелирующая с ДНК, является связующим звеном б переносе наследственной информации от ДНК к другим клеточным субстратам и к белкам в частности. Специфический синтез больщей части РНК, наоборот, может не быть под непосредственным контролем-ДНК - В 1960—1961 гг. сразу в нескольких лабораториях была выделена РНК, соответствующая по составу ДНК, изучены ее свойства и выделены ферментные препараты, катализирующие ее синтез. [c.279]

Ионы металлов редко применяют как единственный способ очистки, а чаще в сочетании с другими методами, такими как фракционирование при помощи солей или спиртов. Иногда тяжелые металлы используют для осаждения балластных белков из ферментного препарата это можно делать только тогда, когда доказано специфическое сродство металла к определенным реакционноспособным группам некоторых типов белковых молекул. Благодаря такой специфичности металлы, подобранные соответствующим образом, можно использовать также для улучшения кристаллизации ферментов из смеси или для их дробного осаждения. [c.148]

Активность микробных ферментов наибольшая. Ферменты почвы принимают участие в круговороте углеводов и белков, которые попадают в грунт в виде растительных и животных остатков и играют важную роль в формировании урожайности земли. Известно, например, что богатая перегноем плодородная почва содержит большое количество ферментов, тогда как истощенная, бедная органическим веществом — почти не имеет их. Высокая активность ферментов свидетельствует об энергичной жизнедеятельности микрофлоры и высокой активности происходящих в почве биологических процессов. Можно представить себе, что в будущем, для регулирования и ускорения этих процессов, с целью повышения урожайности, в грунт будут вноситься ферментные препараты определенных типов, подобно тому, как сейчас все чаще вносятся бактериальные удобрения. [c.306]

Определяют белок в ферментных препаратах различными химическими и физическими методами. Наиболее чувствительным, специфичным и удобным для быстрого определения белка является фотометрический метод Лоури, опубликованный во многих руководствах. [c.135]

Концентрацию фермента рекомендуется выражать в величинах Е на I мл раствора, а удельную активность — в ферментных единицах Е на I мг белка. Последняя величина зависит от чистоты препарата, и поэтому при определении удельных каталитических активностей недостаточно очищенных препаратов фактически указывают лишь нижний предел активности, а для двух произвольных ферментов с различным молекулярным весом сравнение удельных активностей в общем случае не отражает их истинные каталитические свойства. В отличие от этого молекулярная активность фермента, равная эффективной константе скорости распада фермент-субстратного комплекса, является более точной физико-химической характеристикой. Эту величину определяют как число молекул субстрата, превращаемого за 1 мин одной молекулой фермента в условиях субстратного насыщения. Она равна числу ферментных единиц Е в одном микромоле фермента, поскольку сама единица количества фермента Е выражена в микромолях субстрата, превращаемого за 1 мин. Естественно, что молекулярную активность можно определить лишь для достаточно чистых ферментных препаратов. Связь между удельной и молекулярной активностью выражается соотношением [c.59]

Величина Аз характеризует активность фермента как катализатора. За условную единицу количества фермента Е ферментную единицу) принимают такое количество, которое необходимо для превращения одного микромоля субстрата в 1 мин при стандартных условиях температуре 25 °С, оптимуме pH и при субстратном насыщении. Согласно этому определению количество Е находят по предельной начальной скорости превращения субстрата. Концентрацию фермента выражают в числе ферментных единиц на 1 мл раствора, а удельную активность — в числе ферментных единиц на 1 мл белка. Удельная активность для недостаточно очищенных препаратов дает нижний предел активности. [c.513]

Фармакокинетика раздел фармакотерапии и клинической фармакологии, предметом которого является изучение процессов всасывания, распределения, связывания с белками, биотрансформации и выведения лекарственных веществ (ЛВ). Фармакокинетика относительно новая наука, развитие которой стало возможным благодаря разработке методов математического моделирования фармакокинетических процессов, а также разработке и внедрению в практику высокочувствительных методов определения содержания ЛВ в биологических средах газожидкостной хроматографии, радиоиммунных, ферментно-химических и др. Фармакокинетические исследования проводятся специалистами в области аналитической химии, провизорами, фармацевтами, биологами, однако результаты исследований могут применяться и в медицине На основании данных о фармакокинетике того или иного препарата определяют дозы, оптимальный п>ть введения, режим применения препарата и продолжительность лечения. Регулярный контроль содержания лекарственных средств в биологических жидкостях позволяет своевременно корригировать лечение. [c.4]

Для определения чистоты (или гомогенности) ферментных препаратов в настоящее время наиболее широко используются ультрацентрифугирование и диск-электрофорез. В основе первого из них лежит различная скорость седиментации в ультрацентрифуге белков с различной молекулярной массой (и различной формой молекул). Одним из ограничений данного метода является то, что разные белки могут иметь одну и ту же величину седиментации и не разделяться при ультрацентрифугировании. С другой стороны, белок в растворе может находиться в виде нескольких форм, различающихся по степени агрегации, а следовательно, и по молекулярной массе. Если эти формы не превращаются одна в другую или превращения осуществляются достаточно медленно, на седиментограмме обнаружится несколько пиков, что, однако, не будет свидетельствовать о наличии примесных белков в исследуемом препарате фермента. Недостатком метода является также его невысокая чувствительность, что не позволяет обнаруживать малые количества примесных белков. [c.205]

В отсутствие электрического поля при пропускании раствора целлюлазного ферментного препарата через слой порошковой целлюлозы в рабочей камере установки на целлюлозе адсорбируется некоторое количество ферментов, определяемое их природными адсорбционными характеристиками. Через некоторое время адсорбция прекращается и концентрация ферментов на выходе из рабочей камеры приближается к концентрации на ее входе (рис. 3.9). При включении тока концентрация ферментов на выходе из рабочей камеры резко падает. При увеличении напряженности поля эффективность электроудерживания возрастает вплоть до предельного значения, когда все входящие в рабочую камеру ферменты удерживаются на цел цолозе и их концентрация на выходе из камеры равняется нулю (рис. 3.9). Максимальная эффективность электроудерживания наблюдается при достижении напряженности поля определенной пороговой величины, которая мало зависела от природы ферментного препарата, но была пропорциональна его концентрации в растворе на входе в рабочую камеру. Например, при концентрации раствора (по белку) 1 г/л пороговое значение напряженности поля составляет около 100 В/см. Без отключения тока десорбция ферментов не наблюдается, тогда как [c.88]

Определение тиамина. В большинстве природных источников тиамин встречается в виде дифосфориого эфира — кокарбоксилазы. Последняя, являясь активной группой ряда ферментов углеводного обмена, находится в определенных связях с белком. Для количественного определения тиамина необходимо разрушение комплексов и выделение исследуемого витамина в свободном виде, доступном для физико-химического анализа. Освобождение тиамина из связанного состояния обычно осуществляют с помощью кислотного гидролиза л под воздействием фос-фатазных и протеолитических ферментов. В качестве источника фосфатаз применяют различные ферментные препараты такадиастазу, амилоризин ПЮх, фосфа-ваморин [И, 19]. При pH 4,5 под действием амилаз, содержащихся в этих ферментных препаратах, одновременно происходит и расщепление крахмала, который, адсорбируя на себе витамины, мешает их количественному определению. [c.198]

Для определения активности нитратредуктазы в полученных ферментных препаратах в стеклянные центрифужные пробирки емкостью около 10 мл помещают 20 микромолей (0,2 мл 0,1 М раствора) КНОз, 0,2 микромоля НАД-Нг или НАДФ-Нг (растворы с концентрацией 4—5 микромолей), 1,7 мц 1М ФАД (0,1 мл 1,7-16- миллимолярного раствора), 0,5 мл ферментного препарата и 0,15 М фосфатный буфер с pH 7,0 до конечного объема 1 мл. Инкубацию системы проводят в термостате при температуре 28° в течение 15—30 минут. В конце инкубационного периода к реакционной смеси на холоде прибавляют 0,2 мл 1 М раствора ацетата бария и 5 мл 95—97%-НОГО этанола. Небольшой осадок белка отделяют центрифугированием. В центрифугате определяют нитриты. Для этого к реакционной смеси после осаждения белка приливают 0,2 мл реактива 1. через 7—10 минут 0,2 мл реактива 2. Объем смеси доводят до 10 мл и определяют оптическую плотность раствора на фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром через 10 минут после приливания реактива 2. [c.137]

Для определения протеолитической активлости ферментных препаратов в составе моющих средств нами разработан специальный метод, получивший название ФОЛП . Метод основан на гидролизе казеина ферментом при рН=8,битем--пературе 40° С в течение 60 мин. За единицу протеолитической активности принимается количество фермента, которое катализирует гидролиз 1 г белка (казеина) при расщеплении его на 30% в принятых условиях. Предложена формула для расчета протеолитической активности (ед/г) [c.54]

Выделение и свойства внеклеточной протеазы облигатного термофильного гриба Melanooarpue albomyoee 355. Для получения ферментных препаратов протеаз из культуральной жидкости М. albomyoee 355 испытаны были различные осадите ли белков как органической, так и неорганической природы - этиловый, изопропиловый спирты, ацетон, азотнокислый аммоний в разной степени насыщения. Спирты и ацетон предварительно охлаждали до -20 С и осторожно по стенке колбы прибавляли 2-2,5 объема на объем культуральной жидкости. После определенного времени выдерживания на холоде (4 0 осадки центрифугировали,-надосадочную жидкость сливали, осадок высушивали для определения сухой массы, количества белка и протеолитической активности. [c.70]

В результате очистки подучен ферментный препарат протеазн, содержащий 85 белка и обладающий активностью 1 0 ед/г препарата (степень очистки по активности - в Ш раз, по-.бедку - в 10 раз). Раствор фермента (4 мг/мл) имеет характерную для белков кривую поглощения в ультрафиолетовой зоне спектра с максимумом при 278 нм. Молекулярная масса- протеазы, определенная методами седиментационлого анализа и электрофореза в ПААГ в присутствии /-додецилсульфата, равна 45 ООО (рис.20). [c.75]

В настоящее время 30% всех иммуноанализов в США включают применение изотопных меток. Остальные 70% выполняются в основном с помощью методов, в которых роль меток выполняют флуорофоры или ферменты. Применение нефелометрии ограничено анализом иммунных белков. Инфекционные заболевания в основном диагностируют с помощью гетерогенных методов с применением ферментных меток и бусин в качестве носителей, хотя 30% анализов выполняются с помощью более дешевых методик типа РИА. Контроль лекарственных препаратов осуществляют с помощью гомогенных методик, включающих применение ферментных меток или регистрацию поляризации флуоресценции. В случае анализа гормонов имеется большой выбор как гомогенных, так и гетерогенных методик с радиоактивными, ферментными и флуоресцентными метками. Доля неизотопных методов составляет 65% и имеет тенденцию к росту. Альтернативные методы йммуноана-лиза часто используются внутри определенной диагностической группы, например в анализах на тиреоидный статус. В США наиболее важным фактором является стоимость анализа, а различные технические аспекты обычно имеют второстепенное значение. В частности, 50% инструментального парка, используемого в иммуноанализе, работает с промышленно выпускаемыми реагентами. [c.19]