Точечный мутагенез

Особенно плодотворным подходом к изучению функционирования Бр оказался направленный точечный мутагенез, в результате которого отдельные аминокислоты в молекуле Бр можно заменить на другие. Сопоставление функциональной активности мутагенного белка с белком дикого типа позволяет сделать обоснованный вывод об участии определенных аминокислотных остатков в конкретных фотохимических реакциях Бр и этапах переноса протона. Исследованиями, выполненными на точечных мутантах галобактерий, было показано, что первичным донором и акцептором протона в молекуле Бр являются остатки аспартата Асп 96 и Асп 85 [c.393]

В результате мутагенеза мы получаем клетки, содержащие одно или несколько повреждений в определенных точках — локу-сах хромосомы. Каждое точечное повреждение ДНК, или повреждение одного цистрона (функциональной области ДНК), приводит либо к неспособности синтезировать определенный фермент, либо к появлению способности синтезировать измененный фермент. Все эти мутанты будут аллеломорфны (или попросту аллели) относительно клеток дикого типа по данному генетическому маркеру, или данному цистрону. [c.293]

Сайт-специфичный мутагенез, при котором происходит точечная замена только одного из оснований в молекуле ДНК. [c.337]

Роль возбуждения оснований и их пар уже рассматривалась нами при обсуждении механизмов УФ-мутагенеза. Относительно роли и механизма мутагенного действия свободных радикалов в индуцировании точечных мутаций в настоящее время имеется ограниченное число как экспериментальных, так и теоретических данных. [c.69]

В настоящее время в общедоступных базах данных имеются координаты атомов, полученные методами рентгеноструктурного анализа или ЯМР, для тысяч белков, многие из которых могут служить в качестве биомншеней при разработке новых лекарств. Однако для большинства белков известна лишь аминокислотная последовательность и иногда данные точечного мутагенеза, указывающие на амнинокислоты, важные для связывания определенных лигандов. В последнем случае часто оказывается возможным построение пространственной модели белка-био-мишени, например, по гомологии с белками, для которых известна пространственная структура. Информация же о точечных мутациях, влияющих на связывание лигандов, помогает определить сайт связывания таких лигандов. При наличии гомологии выше 70% моделирование обычно не представляет больших трудностей при гомологии менее 20-40% могут возникать существенные проблемы с точностью модели и рекомендуется применять более усовершенствованные методы, например "метод протягивания нити". Но и при невысокой гомологии часто возможно достаточно неплохое моделирование сайта связывания лигандов (который обычно является более консервативным и для которого "локальная" гомология может оказаться достаточно высокой), а наибольшие ошибки возникают при моделировании петельных областей, как правило, достаточно удаленных от сайта связывания лигандов. [c.73]

Попытки выделить небольшой пептид, моделирующий активный центр молекулы, не увенчались успехом. Использование метода направленного точечного мутагенеза и моноклональных антител к определенным участкам молекулы IL2 показало, что активный центр формируется аминокислотными остатками, находящимися на N- и С-концах молекулы, сближенных в пространственной структуре молекулы за счет дисульфидной связи. [c.229]

Чем обусловлены столь высокая каталитическая эффективность ферментов и их специфичность Это одна из фундаментальных научных проблем, хотя некоторые ее аспекты имеют и прикладное значение. Переход неактивных проферментов в каталитически активное состояние, который наблюдается в клетках при определенных патологических условиях (например, при остром панкреатите), приводит к внутриклеточному перевариванию и разрушению тканей. Проводя фундаментальные иследования механизма действия ферментов, мы в конце концов сможем, используя технологию рекомбинантных ДНК и метод направленного точечного мутагенеза, систематически синтезировать ферменты с более высокой каталитической активностью или новой специфичностью. Некоторые из этих синтетических ферментов могут оказаться мощными терапевтическими агентами. Если мы хотим понять, как действуют металлы на биологические системы, мы тоже должны исследовать их влияние на работу ферЫеитов. [c.91]

Методы генетической инженерии стали важным инструментом биохимических исследований. В частности, они не только открыли возмогкность получения значительных количеств ранее мало доступных белков, в том числе эукариотических, но и возможность внесения направленных точечных изменений в первичную структуру белков, т.е. закхены одного определенного аминокислотного остатка на любой другой произвольно выбранный аминокислотный остаток (в пределах 20 аминокислот, из которых могут строиться полипептидные цепи при трансляции). Это достигается путем замены соответствующего кодона в ге1ю, программирующем исследуемый белок. Такая процедура называется сайт-специфичным мутагенезом. [c.305]

Все рассмотренные тины мутаций фага ведут себя, как правило, как точечные мутации. Нетрудно, однако, получить с помощью, мутагенеза и двойные и тройные мутанты, поврен денные или измененные одновременно в нескольких локусах. Самое важное-свойство бактериофагов — чрезвычайная легкость, с какой опи подвергаются генетической рекомбинации, когда различные му- [c.367]

Ясно, что химический мутагенез имеет прямое отношение к проблеме генетического кода. Особенно интересные заключения можно сделать изучая обратимость мутаганеза, т. е. получение возвратных мутантов (ревертантов) под действием того же самого или другого химического агента. Мы ограничимся рассмотрением только точечных мутаций, вызывающих измеиеиие в одном звене какого-либо белка в клетке, и не будем рассматривать сейчас больших хромосомных аберраций, какие иногда появляются под [c.394]

Одним из основных отличий химического мутагенеза от радиации является специфичность действия химических соединений. Известно много случаев, когда мутагенное для одного организма вещество совершенно не вызывает у другого организма мутаций (В. Н. Никифоров, 1965). Например, уретан, индуцирующий мутации у плодовой мушки, растений и бактерий, совершенно не вызывает их у нейроспоры (Ауэрбах, 1958). Уретан является также канцерогенным для мышей и крыс, но не вызывает опухолей легких у кроликов и морских свинок (Роджерс, 1957) 5-бромдезоксиуридин способен вызвать у бактерии только точечные мутации, а в культуре клеток человека — разрывы хромосом (В. Г. Никифоров, 1965). [c.302]

Известен ряд примеров различной активности природных мутантных форм некоторых а адгидролаз [1195,2101-21033. В случае точечных мутаций появляется возможность сравнивать свойства ферментов, в которых произошла замена одной аминокислоты на д )угую. Однако эти возможности были весьма ограниченны, пока не была разработана технш а направленного мутагенеза (см. обзоры [2104, 21053). С тех пор работы по направленному мутагенезу ферментов стали нарастать лавинообразно (см. [2106-21101). Это направление получило название белковой инженерии ферментов и успешно используется для выявления связи их структуры и функции. [c.198]

Рассмо грпм сначала получение точечных му1 аций. Различаю-два их 1ипа — ai it-специфический и сегмент-специфический ервыи сводится к введению определенной мутации в заданны сг."1 Пг т осуществлении мутагенеза второго типа мутаци [c.258]

Внесение изменений в первичную структуру ДНК, а не белка, имеет ряд преимуществ. Во-первых, поскольку ДНК-это генетический материал, который точно воспроизводится в ходе роста микроорганизмов, его нужно получить лишь один раз. Модификацию самого белка пришлось бы проводить многократно, нарабатывая новые порции. Во-вторых, любое изменение гена приводит к единственном) продукту, тогда как при химической модификации белка часто получается смесь веществ. Наконец, генетическими методами в белке можно заменить любую аминокислоту, химической же модификации белка могут препятствовать стерические или кинетические барьеры. Подход, связанный с мутагенезом in vitro, заключается в том, чтобы осуществить точечные мутации гена в одном или ограниченном числе сайтов и проследить, как это скажется на соответствующем белке. [c.102]

Один из методов химического мутагенеза использовали для замены цитозина на ТИМИН. Для этого ДНК обрабатывали бисульфитом натрия, который при подходящих условиях действует лишь на специфический участок ДНК [43]. Созданы также методы, позволяющие воздействовать на относительно специфические участки нуклеотидной последовательности одноцепочечной ДНК и, после ресинтеза, включать неспари-вающиеся или неправильные основания [44]. Однако в этих методах нельзя точно задать положение точки мутации таким образом, чтобы найти необходимый белок, требуется скрининг множества мутантов. Обойти эту проблему можно посредством мутагенеза с использованием олигонуклеотидов, что открывает путь к введению в ДНК специфических точечных мутаций. [c.102]

В 1978-1979 гг. С. Джиллам и М. Смит с соавторами экспериментально обосновали возможность использования синтетических олигонуклеотидов в качестве мутагенов (рис. 6.10, а). Объектом мутагенеза авторы выбрали фаг 0X174, имеющий небольшую одноцепочечную кольцевую ДНК, для которой уже была известна последовательность нуклеотидов. Одноцепочечную кольцевую ДНК гибридизовали с синтетическим олигонуклеотидом, имевшим определенные отличия от соответствующей последовательности фагового генома, например точечную замену одного из нуклеотидов. Данный олигонуклеотид использовали в качестве праймера для достройки второй цепи на ДНК- [c.180]

Химический мутагенез. Для получения точечных мутаций в определенном участке молекулы чаще всего используют дуплексную кольцевую ДНК, содержащую короткий одноцепочечный участок. Один из способов создания таких сайт-специфических пробелов состоит в обработюг сверхспиральной ДНК соответствующей рестриктирующей эндонуклеазой в присутствии бромистого этидия, который встраивается между плоскостями пар оснований и вносит нарущения в структуру дуплекса (рис. 7.33, А). При этих условиях многие рестриктирующие эндонуклеазы разрезают только одну из цепей в соответствующих сайтах. По-видимому, при встраивании бромистого этидия в обычную дуплексную молекулу ДНК разрезания вообще не происходит, а в сверхспиральной молекуле разрезается только одна цепь. Не все рестриктирующие эндонуклеазы ведут себя подобным образом, но все же число их достаточно велико. После разрезания молекулы с помощью экзонуклеазы в дуплексной молекуле создают небольшой одноцепочечный пробел в месте разреза. Альтернативный способ полу- [c.344]

Сайт-специфический мутагенез с применением синтетических олигодезоксинуклеотидов. Олиго-дезоксинуклеотиды можно синтезировать в больщих количествах, что позволяет разработать достаточно универсальные методы получения сайт-специ-фических точечных мутаций в клонированных сегментах ДНК. В основе одного из таких методов лежит образование гетеродуплекса между одноцепочечным синтетическим олигодезоксирибонукле-отидом, содержащим мутантную последовательность, и комплементарной одноцепочечной рекомбинантной векторной ДНК, несущей соответствующий сегмент дикого типа (рис. 7.36). Для этого ген, в котором мы хотим получить мутацию, клонируют, например, в фаге М13 и получают одноцепочечную кольцевую рекомбинантную вирусную ДНК. Затем с этой кольцевой молекулой отжигают [c.347]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология