Белковая инженерия ферментов

Горизонты энзимологии. В литературе появляются работы, в которых делаются попытки прогнозирования дальнейшего развития энзимологии на ближайшее десятилетие. Перечислим основные направления исследований энзимологии будущего. Во-первых, это исследования более тонких деталей молекулярного механизма и принципов действия ферментов в соответствии с законами югассической органической химии и квантовой механики, а также разработка на этой основе теории ферментативного катализа. Во-вторых, это изучение ферментов на более высоких уровнях (надмолекулярном и клеточном) структурной организации живых систем, причем не столько отдельных ферментов, сколько ферментных комплексов в сложных системах. В-третьих, исследование механизмов регуляции активности и синтеза ферментов и вклада химической модификации в действие ферментов. В-четвертых, будут развиваться исследования в области создания искусственных низкомолекулярных ферментов —синзимов (синтетические аналоги ферментов), наделенных аналогично нативным ферментам высокой специфичностью действия и каталитической активностью, но лишенных побочных антигенных свойств. В-пятых, исследования в области инженерной энзимологии (белковая инженерия), создание гибридных катализаторов, сочетающих свойства ферментов, антител и рецепторов, а также создание биотехнологических реакторов с участием индивидуальных ферментов или полиферментных комплексов, обеспечивающих получение и производство наиболее ценных материалов и средств для народного хозяйства и медицины. Наконец, исследования в области медицинской энзимологии, основной целью которых является выяснение молекулярных основ наследственных и соматических болезней человека, в основе развития которых лежат дефекты синтеза ферментов или нарушения регуляции активности ферментов. [c.117]

Достижения белковой инженерии в повышении стабильности ферментов [c.399]

В частности, методами белковой инженерии, сущность которых состоит в изменении первичной структуры природной молекулы фермента посредством химической модификации самого энзима или его гена, удается принципиально трансформировать структуру активного центра и его функцию, модулировать субстратную специфичность и физико-химические свойства фермен- [c.84]

В связи с экспрессией генов большое значение приобретает "белковая инженерия", дорожку которой проторила генетическая инженерия, первая вытекает из второй и, следовательно, белковая инженерия также является методом науки "Биологическая технология" Целевые установки здесь сводятся к изучению и пониманию главного звена в структуре ферментов (почему они функционируют так, а не иначе ), к возможности научиться видоизменять природные белки или, того больше, уметь их заново проектировать, к выяснению причин и механизмов изменения фенотипа под влиянием генотипа [c.211]

Тип реакции прямые реакции окисления — восстановления использование обычных ферментов для проведения нетривиальных реакций белковая инженерия, нацеленная на изменение свойств катализатора использование биокатализа в неводных средах. [c.178]

Использование метода белковой инженерии уже дало первые успехи в стабилизации ферментов. Оценивая перспективы метода, следует помнить, что он является и в течение некоторого времени будет оставаться довольно дорогостоящим. Поэтому наиболее эффективным будет его использование в случае тех ферментов, которые, во-первых, сами достаточно дорого стоят, и, во-вторых, инактивация которых связана с химической модификацией какой-то ключевой группы, существенной для инактивации белка (например, окислением SH-группы вблизи активного центра или дезамидированием остатков аспарагина). [c.134]

Накопленные в последние годы данные физико-химических исследований ферментов, и прежде всего рентгеноструктурного анализа, показывают важность отдельных горячих точек в структуре ферментов. Влиять на эти точки можно только методами белковой инженерии, которые открывают путь к избирательной точечной модификации ферментов. Именно на этом пути ожидаются новые результаты по получению высокостабильных ферментов с заданными свойствами. В частности, можно будет создавать гибридные молекулы, содержащие различные функционально активные центры, например гибриды ферментов, катализирующих определенную последовательность процессов. [c.135]

Интерес к направленному изменению свойств ферментов не ограничивается запросами современной индустрии и медицины. Исследование механизмов биокатализа и особенностей структур-но-функциональных взаимоотношений в белках имеет большое фундаментальное значение, поскольку все эти явления лежат в основе жизни. А говорить о понимании природы ферментативного катализа можно только после искусственного создания полипептидов с заранее заданными признаками. Получением белков и ферментов с новыми свойствами занимается одно из наиболее активно развивающихся направлений современной молекулярной биологии - белковая инженерия. [c.273]

У белковой инженерии большое будущее. Но даже достижения сегодняшнего дня в данной области весьма значительны. Мы являемся свидетелями активного использования белков и ферментов для крупномасштабного тонкого химического синтеза, эффективного разделения рацемических смесей энантио-меров, в качестве биосенсоров, лекарственных средств при заместительной терапии многих заболеваний человека, для получения пищевых продуктов, детергентов и эффективных моющих средств. Все это требует проведения поиска еще более эффективных биокатализаторов, в том числе и создания искусственных измененных ферментов методами белковой инженерии. Наш краткий обзор не ставит задачи дать исчерпывающую картину полученных результатов, и основной акцент делается на использовании генно-инженерных методов при конструировании белков с новыми свойствами. Однако было бы несправедливым умолчать о химических подходах получения биокатализаторов с новыми свойствами, активно применяемых в современной биотехнологии. [c.369]

Огромное значение для молекулярной биологии последнего десятилетия имеет развитие генетической инженерии (возникшей в 1972—1973 гг. П. Берг, П. Лобан, С. Коэн и Г. Бойер) и методов работы с рекомбинантными ДНК в сочетании с методами химического синтеза крупных фрагментов ДНК. В результате сделались доступными для исследования индивидуальные гены и регуляторные генетические элементы, было стимулировано изучение ферментов биосинтеза и обмена нуклеиновых кислот. Благодаря этому после 1977 г. были обнаружены мозаичное (экзон-интронное) строение генов, явление сплайсинга и ферментативной активности у РНК, усилители ( энхансеры ) экспрессии генов, многие регуляторные белки, онкогены и онкобелки, мобильные генетические элементы. Возникла белковая инженерия, которая позволяет получать новые, не существующие в природе белки. Молекулярная биология начала оказывать существенное влияние на развитие биотехнологии, медицины и сельского хозяйства. [c.9]

Рис. 58. Ферментативные реакции, иллюстрирующие три подхода к изменению субстратной специфичности ферментов методами белковой инженерии

С увеличением стоимости исходных субстратов реакции и расширением возможностей белковой инженерии в отношении изменения свойств ферментов в нужную сторону структура издержек производства начинает меняться. При проектировании современного биотехнологического процесса все чаще становится возможным брать за основу свойства реакций как таковых и технические возможности их проведения, а биокатализатор со- [c.454]

Умение индуцировать мутации в клонированных генах с целью получения мутантных белков лежит в основе белковой инженерии. При этом используют две группы методов, приводящих к разным последствиям на молекулярном уровне. Первая группа основана на случайном мутагенезе, т.е. введении в мутагенизиру-емый участок гена многих мутаций, положение каждой из которых не контролируется исследователем, а ограничивается лишь размером фрагмента нуклеиновой кислоты, в который эти мутации вводятся. Более или менее случайный мутагенез имеет место, в частности, при инкубации нуклеиновых кислот с химическими мутагенами или осуществлении их синтеза с помощью ДНК-полимераз с ослабленной специфичностью в отношении субстра-тов-предшественников. Совокупность этих подходов активно используется при проведении направленной эволюции белковых молекул. Вторая группа методов, получившая название направленного или сайт-специфического мутагенеза, обеспечивает введение мутаций в строго определенные участки нуклеиновых кислот, что позволяет заменять отдельные аминокислотные остатки в кодируемых этими молекулами белках и ферментах. Направленный мутагенез является сердцем (но не мозгом) рационального дизайна и редизайна белковых молекул, к рассмотрению которого мы сейчас переходим. [c.278]

Известен ряд примеров различной активности природных мутантных форм некоторых а адгидролаз [1195,2101-21033. В случае точечных мутаций появляется возможность сравнивать свойства ферментов, в которых произошла замена одной аминокислоты на д )угую. Однако эти возможности были весьма ограниченны, пока не была разработана технш а направленного мутагенеза (см. обзоры [2104, 21053). С тех пор работы по направленному мутагенезу ферментов стали нарастать лавинообразно (см. [2106-21101). Это направление получило название белковой инженерии ферментов и успешно используется для выявления связи их структуры и функции. [c.198]

Хотя гибридомные технологии еще продолжают достаточно активно использоваться, с появлением новых эффективных методов белковой инженерии, в том числе систем отбора белков на основе разнообразных дисплеев и репрезентативных клонотек случайных белковых последовательностей, mAb начинают постепенно сдавать свои позиции. Новые технологии позволяют отбирать антитела требуемой специфичности непосредственно из суспензии фаговых частиц без иммунизации лабораторных животных и при этом получать белки с совершенно новой специфичностью к антигенам, которые неиммуногенны in vivo. Новые подходы дают возможность снять ограничения, накладываемые на производство антител особенностями иммунного ответа живого организма. В последние годы удалось получить большое количество рекомбинантных антител с новыми свойствами значительно уменьшить размер их молекул, а также объединить антитела в поливалентные гибридные комплексы, сильно повысив при этом их авидность. Генно-инженерными методами удалось объединить фрагменты антител с разнообразными аминокислотными последовательностями для обеспечения адресной доставки макромолекул. Такие гибридные молекулы, кроме антител, включают ферменты для активации предшественников цитоток-сичных лекарственных препаратов, токсины, белки вирусных частиц, используемые в генотерапии, и сами могут быть включены в липосомы для повышения эффективности химиотерапии. Рекомбинантные антитела применяют для получения биосенсоров, используемых при мониторинге исследуемых молекул в реаль- [c.409]

Редактирование , происходящее в процессе эволюции, затрагивает биологически функциональную часть глобулы, ее активный центр. Активный центр белка-фермента включен в каркас, обладающий некоторой конформационной подвижностью. Точная структура каркаса не играет определяющей роли. Поэтому структура белка как целого мало связана с его функцией. Это создает важные возможности для белковой инженерии, для искусственного построения белков, применимых в биоэлектронике. Первые шаги в этом направлении уже сделаны. Так, синтезирован Felix — искусственный белок, содержащий четыре а-спирали (Four heli es). [c.112]

Такие направленные изменения в белках (белковая инженерия) стали важным инструментом для установления роли отдельных аминокислотных остатков в формировании пространственной структуры белка и выполнении им своих функций. В качестве примера можно привести результаты исследования роли остатка тирозина-248, входящего в активный центр карбоксипептидазы А (см. 6.1). После установления пространственной структуры этого фермента с помощью рентгеноструктурного анализа высказывалась точка зрения, что гидроксигруппа этого остатка принимает участие в подаче протона на атом азота гидролизуемой пептидной связи и одновременно в удалении протона от молекулы атакующей воды. Однако, когда методом сайт-специфичного мутагенеза была осуществлена замена этого остатка тирозина на фенилаланин, оказалось, что каталитичесюш свойства фермента практически не изменились. Таким образом, роль гидроксигруппы тирозина-248 в катализе не подтвердилась. [c.306]

В будущем открываются широкие возможности для конструирования новых ферментов. Одна из них — направленное изменение отдель-ньгх аминокислот путем изменения генов, которые кодируют ферменты. Мы все глубже познаем законы, по которым белки принимают специфическую трехмерную конфигурацию, поэтому не исключено появление в ближайшем будущем соверщенно новых сконструированных ферментов. Это направление называется белковой инженерией. Кроме того, чем больше мы узнаем о том, как работают ферменты, тем более вероятно, что мы сможем сконструировать небелковые или частично небелковые катализаторы, которые гораздо стабильнее, чем обычные ферменты. Возможно, именно это направление окажется самым привлекательным для предпринимателей. Среди направлений, которые окупятся немедленно, — поиск природных ферментов, являющихся более совершенной альтернативой используемым в настоящее время. Все это требует огромных инвестиций в исследования и разработки. [c.86]

Белковая инженерия. В начале 80-х годов в генетической инженерии был разработан метод, позволяющий получать измененные белки, отличающиеся от белков-прототипов заменой всего лищь одного аминокислотного остатка в строго заданном положении. Для биотехнологии этот метод, названный сайт-специфическим мутагенезом, или белковой инженерие интересен тем, что позволяет целен равЛеннб изменять структуру ферментов, а значит, их каталитические свойства и стабильность. [c.133]

Большие надежды связывают с направленным изменением генов в составе плазмид in vitro. На основе этого метода ведутся работы по так называемой белковой инженерии, позволяющие изменять в нужном направлении ферменты, кодируемые этими генами. Стало актуальным применение методов генной инженерии при создании продуцентов для микробиологической промышленности. [c.564]

Исследователи, работающие в области направленной эволюции, изначально используют клонотеки последовательностей, которые, несмотря на случайный характер их создания, охватывают лишь небольшую часть теоретически возможного пространства последовательностей, представляющего набор молекул с аминокислотными остатками (или нуклеотидами) во всевозможных сочетаниях. Поскольку такие клонотеки получают руками экспериментатора, то с их помощью можно конструировать макромолекулы, не встречающиеся в природных условиях. Однако размер полного пространства последовательностей слишком велик, чтобы с ним можно было работать экспериментально. Поэтому в белковой инженерии на практике часто реализуют компромиссный вариант подхода, в котором в качестве исходной последовательности при конструировании нового фермента используют известную последовательность с исследованной пространственной структурой, функциональность которой уже была апробирована в природе. В этом случае на основе имеющихся знаний о структуре и механизмах функционирования активного центра исходного фермента с помощью направленного мутагенеза заменяют конкретные аминокислотные остатки в надежде получить фермент с требуемыми свойствами. Такой подход получил название рационального редизайна. Одним из плодотворных подходов в этом направлении исследований является инженерия белковых поверхностей (pat h engineering), при котором с помощью мутаций изменяют участки полипептидной цепи в окрестностях аминокислотных остатков, сближенных на поверхно- [c.275]

Переходя к обсуждению результатов по созданию белков и ферментов с новыми функциями, которые удается получать методами рационального дизайна в белковой инженерии, необходимо сформулировать два важных понятия, которые часто используются в молекулярной генетике. Совокупность всех возможных последовательностей аминокислотных остатков полипептидной цепи (или полинуклеотида) определенной длины составляет ее полное пространство последовательностей (sequen e spa e). Например, полное пространство последовательностей 100-звенной полипептидной цепи, построенной из 20 природных аминокислотных остатков, будет представлено 20 о (-lO o) последовательностями. Хотя полное пространство последовательностей является п-мерным и его невозможно изобразить графически, для удобства обсуждения его часто изображают в виде двумерной плоскости, где каждая точка плоскости соответствует индивидуальной последовательности этого пространства (рис. 31). [c.284]

Докериновые домены могут быть объединены с другими ферментами в составе гибридных полипептидных цепей, что будет обеспечивать взаимодействие таких рекомбинантных белков со скелетной последовательностью СурА. Более того, хотя коге-зиновые домены обладают высокой гомологией, они не полностью идентичны и предпочтительно взаимодействуют с докериновыми доменами определенной первичной структуры. Это создает условия для упорядоченной сборки каталитических субъединиц, вводимых в состав мультиферментного комплекса, на скелетной последовательности по воле исследователя путем линейного упорядочивания когезиновых доменов вдоль полипептидной цепи СурА методами белковой инженерии [176]. Первые результаты использования такого подхода на практике уже получены [177, 178]. [c.377]

В 1986 г. двумя группами исследователей, руководимых P.A. Лернером и П.Г. Шультцем, было показано, что молекулы антител могут обладать ферментативной активностью [273, 274]. С этого времени берет начало новое направление белковой инженерии по искусственному конструированию ферментов на основе полипептидных цепей иммуноглобулинов, которые получили название каталитических антител или абзимов. Более того, вскоре после этого открытия в организме человека были обнаружены абзимы, появление которых ассоциировано с некоторыми распространенными заболеваниями. Результаты данных исследований еще раз подчеркивают плодотворность рационального подхода к решению проблем белковой инженерии, который по мере углубления знаний о механизмах функционирования белковых молекул, несомненно, станет доминирующим. [c.427]

Подходы, основанные на химической белковой инженерии, также дают возможность оказывать весьма существенное влияние на субстратную специфичность ферментов. В результате реализации таких подходов удается сочетать высокую избирательность катализа, которую обеспечивает полипептидная цепь, с каталитической универсальностью синтетических активных центров. Эффективность применения данной группы методов иллюстрируют результаты, полученные с классическим объектом белковой инженерии - сериновой протеиназой субтилизином [318]. Фермент был закристаллизован и непосредственно в кристаллическом состоянии стабилизирован поперечными сшивками с помощью глутарового альдегида. В таком состоянии субтилизин оказался нерастворимым в воде и органических растворителях, и демонстрировал очень высокий уровень стабильности. Далее остаток Ser-221, находящийся в активном центре субтилизина, был превращен химическими методами в производное селеноцистеи- [c.441]

Эндонуклеазы рестрикции класса II, которые обладают уникальной способностью расщеплять ДНК по специфическим сайтам рестрикции, широко используются в генной инженерии (см. раздел 2.1 в первой части книги). Кроме того эти ферменты являются излюбленным объектом фундаментальных исследований, в ходе которых предпринимаются попытки объяснения их высокой специфичности. В настоящее время имеются данные рентгеноструктурного анализа, по крайней мере, для 12 рестриктаз, в том числе свободных ферментов, а также ферментов в комплексе с ДНК, содержащими соответствующие сайты рестрикции, и неправильными ДНК-субстратами. Среди этих ферментов эндонуклеаза ЕсоКЧ наиболее хорошо изучена и чаще всего используется в белковой инженерии [319]. [c.442]

Успехи белковой инженерии, демонстрирующие возможность изменения субстратной специфичности ферментов путем замены одной или нескольких аминокислот с помощью рационального редизайна или эволюционных подходов, наводят на многочисленные размышления. В частности, возникает вопрос почему изменения субстратной специфичности ферментов являются редким событием, а мутации в конкретном гене, как правило, сопровождаются ослаблением или потерей ферментативной активности вообще В силу ограниченности наших знаний о структурно-функциональных взаимоотношениях в белках ответ на такой вопрос кажется очевидным одиночные замены аминокислот в активном центре фермента или его окрестностях приводят к конформационным или иным изменениям полипептидной цепи, делающим активный центр нефункциональным в отношении своего природного субстрата. [c.447]

Конструирование ферментов методами белковой инженерии сопровождается постепенным освоением новых областей исследуемого пространства последовательностей и на зтом пути продвижения в неведомое наблюдается значительный прогресс (рис. 59). Методы классического скрининга белков с новыми свойствами, основанные на последовательном переборе отдельных различающихся последовательностей, дают возможность исследовать лишь очень ограниченное количество не связанных друг с другом представителей из теоретически доступного пространства последовательностей в разных его областях. Картина изменяется лишь незначительно при анализе большого количества геномов разных видов в процессе метагеномного скрининга. Методы направленного и случайного мутагенеза позволяют незначительно отклониться от исходной последовательнбсти и исследовать пространство последовательностей в ее окрестностях. Случайное объединение доменов разных белков и, особенно, комбинаторная перетасовка нуклеотидных последовательностей разных геномов дают возможность обследовать брлее удаленные друг от друга области пространства последовательностей. Тем не менее, наши современные возможности пока не позволяют подойти к решению этой проблемы более широко, и в исследуемом [c.460]

Смотреть страницы где упоминается термин Белковая инженерия ферментов: [c.5] [c.208] [c.163] [c.6] [c.39] [c.304] [c.346] [c.374] [c.375] [c.382] [c.397] [c.398] [c.400] [c.400] [c.429] [c.436] [c.442] [c.445] [c.240] [c.443]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология