Клонирование космид

Манипуляции с X векторами. Клонирование космид и [c.190]

Фаговые векторы. Космиды. ВАС- и YA -векторы. Векторы на основе бактериальных плазмид широко используются для клонирования, но у них есть один важный недостаток — небольшая емкость. В таких векторах можно клонировать фрагменты в среднем не более 7—8 т. н. п., а последовательности эукариотических генов гораздо длиннее (в среднем IО—25 т. н. п). Кроме того, для изучения регуляторных последовательностей, находящихся за пределами кодирующей части генов, необходимо клонировать еще более протяженные области генома. Оказалось, что для клонирования таких фрагментов плазмидные векторы не подходят. Дело в том, что плазмиды, содержащие большие вставки хромосомной ДНК (более 8 т. н. п.), нестабильны и при репликации постепенно уменьшаются в размере в результате делеций нуклеотидов чужеродной ДНК. [c.40]

Для выделения и исследования более длинных генов или группы соседних генов с прилежащими к ним последовательностями необходимо клонировать фрагменты ДНК еще большей длины (30—45 т. н. п.). Для клонирования таких фрагментов были сконструированы специальные векторы с большей емкостью — космиды, представляющие собой гибридную молекулу, содержащую специальный os-участок генома фага, за счет чего они могут упаковываться в головку фага X, и специальные последовательности, позволяющие им реплицироваться по плазмидному типу. Размер космиды довольно мал по сравнению с фаговым вектором — всего 5 т. н. п. и, следовательно, в космиду можно вставить чужеродную ДНК значительных размеров (30—45 т. н. п.). Фаговые головки, содержащие такую рекомбинантную ДНК, не могут размножаться как фаги. Ими трансформируют клетки Е. соИ. Гибридная молекула, содержащая эукариотическую ДНК, обрамленную os-сайтами, размножается в Ё. соИ как плазмида, и каждая фаговая частица вызывает образование колонии индивидуального бактериального трансформанта [c.41]

Любая ДНК, находящаяся между двумя со5-сайтами, может быть упакована в оболочку фага. На этом основан метод клонирования с использованием космид , описанный в гл. 19. Важно, однако, чтобы расстояние между двумя со5-сайтами не сильно отличалось от естественной длины фага лямбда. Если это расстояние будет слишком большим или слишком малым, то ДНК не будет упакована в оболочку. Этот факт свидетельствует о том, что для завершения процесса упаковки количество ДНК должно быть достаточным и что в головке фага может поместиться совсем немного избыточной ДНК (примерно 15%). [c.346]

Используемые при клонировании фаги X могут включать до 20 т. п. н. интегрированной чужеродной ДНК. С другой стороны, космиды (гибрид фага X с плазмидой) могут включать и переносить до 54 т. п. н. чужеродной ДНК. Что бы вы выбрали при создании библиотеки ДНК человека и почему Геном человека содержит около 3-10 нуклеотидных пар. [c.293]

Космидный вектор следует предпочесть вектору для клонирования на основе фага X, поскольку при использовании космид для полного перекрывания человеческого генома представительная библиотека должна включать меньшее количество клонов. Необходимое в каждом из случаев количество клонов можно рассчитать, как описано в приложении 9.2 [c.282]

Были сконструированы специальные векторы, в которых содержались промоторы для РНК-полимераз фагов 5Р6, Т7 пли ТЗ, расположенные в непосредственной близости от сайтов клонирования распространенных фаговых и космидных векторов. Наличие таких промоторов делает возможным быстрый синтез радиоактивных РНК-зондов, специфичных по отношению к концам клонированного фрагмента ДНК полученные зонды представляют собой идеальный инструмент для прогулки по геному . Это общий метод выделения фрагментов ДНК, располагающихся в геноме по соседству с уже клонированным в составе соответствующего вектора участком ДНК. Постановка таких экспериментов с использованием космид описана в работе [26] и гл. 2 этой книги. [c.37]

Клонирование в космидах технически труднее, чем клонирование в фаге Я его следует избегать, за исключением тех случаев, когда оно диктуется интересами постановки эксперимента или решения каких-либо биологических проблем. Методики, детально описанные в этой главе, в большинстве случаев надежны в работе. Однако не следует рассматривать их как нечто обязательное. Описаны и другие методы и, конечно, возможны различные модификации. [c.72]

Понятие клон определяе гея как большая популяция идентичных молекул, бактерий или клеток— потомков одного предка. Клонирование позволяет получать большое количество идентичных молекул ДНК, которые можно охарактеризовать и использовать в каких-то целях. Метод клонирования основан на том факте, что химерные или гибридные молекулы ДНК могут быть сконструированы в составе векторов для клонирования, к которым относятся бактериальные плазмиды, фаги или космиды, способные к репликации в хозяйских клетках под контролем своих собственных регуляторных элементов. Таким путем добиваются амплификации химерной ДНК. Общая схема процесса клонирования представлена на рис. 36.3. [c.40]

Клонирование в космидах (размер вставки 37 т.п.о.) 6,4 х 10 [c.47]

Однако после адсорбции химерной фаговой частицы на поверхности бактериальной клетки заключенная в ней ДНК проникает (вводится фаговой частицей) внутрь бактерии и начинает автономно реплицироваться как плазмида, размер которой составляет 30 0 т.п.о. Поскольку такая плазмида (космида) содержит в своем составе селектируемые маркеры в виде генов устойчивости к антибиотикам, ее поддерживают в бактериальных клетках путем выращивания бактерий на среде с соответствующими антибиотиками. Несмотря на то, что емкость космидных векторов значительно выше фаговых, эффективность клонирования в космидах ниже, хотя и достигает в ряде случаев [c.85]

Рис 7 9 Схема клонирования генов с помощью космиды, имеющем один со5-сайт Направление os сайта указано черной стрелкой I сайт рестрикции [c.218]

Выбор ферментов, используемых для двойного расщепления космидного вектора при приготовлении плеч по методу Иш-Горовица и Берка [10], определяется характеристиками данной космиды. На рис. 2.1 приведена схема общего метода для любого космидного вектора. Методика, детально описанная в табл. 2.2, касается семейства космид Лориста [7, 8], где фермент X — это Sstl, фермент Y — BsffiH, а сайт клонирования Я1Пс1П1. [c.47]

Рис. 2.1. Конструирование рекомбинантов по методу Иш-Горовица и Берка [10]. с — сайт клонирования, х и у — другие уникальные рестрикционные сайты. Космиды расщепляют один препарат по сайту х, другой по сайту у и обрабатывают фосфатазой. Затем каждый препарат разрезают по сайту с. Нужные плечи — те, которые несут со5-сайты в правильной (показано маленькой стрелкой) ориентации. Желательно, хстя и необязательно, индивидуально выделять необходимые фрагменты до лигирования. Методика построена так, чтобы исключить образование мультимеров космид, которые могли бы эффективно вовлекаться в упаковку.

Клонирование с помощью рекомбинации позволяет с наи-меньщими усилиями скринировать большое множество космид. В основе метода лежит тот факт, что фаг К в общем случае не является трансдуцирующим фагом, т. е. упаковывается только ДНК, расположенная между двумя os-последовательностями, разделенными достаточным расстоянием. [c.62]

Индукция профага приводит к упаковке космиды Кт , но не плазмиды Ар Однако если между фрагментами ДНК, клонированными в космиде и в плазмиде, имеется гомология, то между гомологичными последовательностями может с частотой 10 произойти рекомбинация, в результате которой оба вектора объединяются в одну крупную кольцевую космиду. Только в этом случае упаковка обеспечит возможность трансдукции обоих маркеров Д /п и Лр . Поэтому для клонирования какого-либо гена достаточно лишь вставить небольшой фрагмент его ДНК в плазмиду-зонд, содержащуюся в линии хелперных клеток, суперинфицировать их космидной библиотекой (упакованной, как указано в разд. 2.2.8.5), индуцировать профаг в хелперных клетках и высеять их на чашки с Km и Ар. Колонии с двойной лекарственной устойчивостью должны в принципе содержать ген, клонированный в космиде, в которую интегрировала плаз-мида-зонд. [c.62]

Недавно сконструированы векторы, содержащие промоторы SP6, Т7 или ТЗ, непосредственно примыкающие к сайтам для клонирования ([8] и неопубликованные результаты). Это позволяет быстро и легко приготовить меченные згр РНК-зонды, специфичные в отношении концов клонированной ДНК и поэтому очень подходящие для использования в качестве зонде в для идентификации новых космид, вставки в которых перекрываются со вставкой в исходной космиде. Этот процесс выделения перекрывающихся клонов известен как прогулка по геному, причем использование промоторных систем SP6/T7/T3 может существенно уменьшить время и труд, затраченный на проведение такой прогулки , поскольку при этом отпадает необходимость в идентификации концов клонированных фрагментов с помощью рестрикционного картирования и физического выделения этих фрагментов для приготовления новых зондов. [c.65]

TOB для клонирования, защищенных терминаторами РНК-полимеразы. Одно такое семейство космид, основанное на Я-репли-коне, уже получено [7]. [c.72]

Принцип метода схематически показан на рис. 3.2. Космидные библиотеки, сконструированные в гесЛ -клетке, упаковывают в Я-частицы, чтобы получить лизат с высоким титром трансдуцирующих частиц. Аликвоты упакованной библиотеки используют затем для заражения гес+-клеток, в которые предварительно введена последовательность (или последовательности) -зонд, клонированная в плазмиде, не имеющей гомологии с космидным вектором. Через 30 мин — 2 ч, в течение которых должна произойти рекомбинация, космиды вновь упаковывают в фаговые частицы. Упакованные космиды используют для заражения гесЛ -хозяина, проводя селекцию по обоим маркерам лекарственной устойчивости — плазмидному и космидному. Поскольку плазмида не несет os-последовательностей, она будет перенесена в реципиентные клетки только в случае рекомбинации с гомологичной последовательностью в космидном клоне. Для того чтобы восстановить исходную космиду, можно вновь разделить два клопа в результате второго рекомбинационного события и после переноса в нового хозяина идентифицировать ревертантов на индикаторных чашках. Как будет сказано ниже, точное восстановление, однако, не всегда возможно (или желательно). [c.78]

Основное достоинство генетического подхода — быстрота и эффективность метода достаточно большое число экспериментов можно проводить параллельно. Поэтому не возникает нужды в повторном скрининге, что делает этот метод особенно удобным там, где требуется повторное выделение многих космид (например, при прогулке по хромосоме ). Другое преимущество генетического метода — очень высокая чувствительность гомологичной рекомбинации к ошибочному спариванию последовательностей [25, 26], Данное обстоятельство может быть особенно удобным, например, при выделении космид, содержащих конкретные копии тех или иных семейств генов, или в экспериментах по прогулке по хромосоме . Такие эксперименты упрощаются при работе с некоторыми из наших новых векторов (Эрих и др., в печати), содержащих ЫоИ-сашы, фланкирующие инсерционный сайт, что позволяет провести быстрое и избирательное клонирование концевых фрагментов вставки в производных риС18 или рЕМВЬ18, содержащих 7Уо/1-сайты в полилинкере. [c.84]

Может также быть использован и альтернативный двухступенчатый процесс, приводящий к обмену последовательностями между плазмидой и космидой. При использовании подходящей системы селекции или переноса космида или плазмида может быть получена раздельно. Поэтапно, например, можно ввести мутации, индуцированные в коротком районе гена, клонированного в упаковывающейся плазмиде, обратно в космиду. Наоборот, можно перенести последовательности из космиды в плазмиду для дальнейшего анализа. Как показано на рис. 3.4, такой процесс особенно хорошо контролируется в двухэтапном варианте метода, когда исходная маркерная последовательность (например, /ас-оператор) вводится в результате двойной рекомбинации в тот локус космиды, который должен быть мутагенизирован. Обмен этой последовательности на последовательности, несущие желательную мутацию, легко обнаружить с помощью теста на присутствие или отсутствие /ас-оператора (см. методику получения реверсий). [c.86]

У плазмид на основе репликона olEI есть и недостатки. Одним из них является снижение числа копий на клетку при увеличении молекулярной массы гибридной плазмиды. Для плазмид этого типа выход рекомбинантов падает с ростом молекулярной массы вставки. Это обстоятельство делает малоэффективным клонирование в плазмидах фрагментов ДНК, превышающих 10 Т.П.О. Для клонирования фрагментов большей длины используют фаговые векторы, космиды и фазмиды. [c.146]

На вышеприведенном частном примере был рассмотрен один из подходов к конструированию клонотеки геномной ДНК с использованием космидного вектора, который иллюстрирует все основные этапы получения клонотек генов с применением и других векторов, плазмидных или фаговых [227, 228]. Во всех случаях для получения репрезентативных клонотек генов следует по-itiHHTb о необходимости случайной фрагментации клонируемой высокомолекулярной ДНК, чтобы все участки генома в образующейся смеси фрагментов были представлены равновероятно, роме того, размеры образуемых фрагментов ДНК должны соответствовать емкости вектора, используемого для их клонирования. Так, для клонирования в космидах необходимо получать фрагменты ДНК длиной 35-45 т.п.о., тогда как для клонирования в фаговых векторах типа haron и плазмидах эти размеры должны составлять соответственно 20-24 и 1,5-3,0 т.п.о. [c.157]

Обычно космиды конструируют на базе плазмиды pBR322. Техника клонирования генов с их помощью заключается в следующем. Космиду линеаризуют рестриктазой через сайт клонирования и [c.217]

Современные космиды имеют полилинкеры го краям которых расположены сайты для редкощепящих рестриктаз с целью вь пезания клонированных фрагментов, или фаговые промото- [c.220]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология