Селекция на амплификацию генов

Методики селекции на амплификацию генов [c.245]

Ниже мы рассмотрим детально лишь факторы, имеющие, по-видимому, важное значение для выбора стратегии экспрессии гена. Это стабильность амплифицированных последовательностей в отсутствие селекции, структура вектора и частота амплификации гена. [c.260]

Причины появления в одних случаях гомогенно окрашенных районов, а в других — DM пока неясны. По-видимому, конструкция вектора здесь не играет роли, а определяющее значение имеют природа клеток-хозяев и характеристика сайта первичней интеграции. Так, например, две наиболее часто применяемые линии клеток хомяка СНО и ВНК-21 обеспечивают преимущественно стабильную амплификацию гена, а у мышиных фибробластов и некоторых линий опухолевых клеток человека преобладает DM-форма [2]. Таким образом, если во главу угла ставить стабильность амплифицированных последовательностей в отсутствие селекции, то предпочтение следует отдать клеткам [c.260]

Селекция на амплификацию данного гена в составе рекомбинантной конструкции позволила достичь максимально высокого уровня экспрессии для целого ряда секретируемых белков [1]. В принципе любой из генов, перечисленных в табл. 8.1, можно использовать в качестве маркера амплификации вектора. В разд. 8.1.4 описано применение некоторых из этих маркеров при работе с различными клеточными линиями. [c.241]

Лучше всего, если селективный маркер является одновременно и маркером амплификации, поскольку при трансфекции ДНК часто подвергается перестройкам и мутациям, из-за которых не все клоны, экспрессирующие селективный маркер, будут экспрессировать и маркер амплификации. Амплифицируемый ген может служить основой для селекции клонов в том случае, если [c.241]

Продолжительная селекция на устойчивость к метотрексату позволила выделить как стабильные, так и нестабильные по этому признаку линии клеток. Какова пе.р-воначальная ступень в амплификации гена На первых ступенях отбора большинство или все резистентные клетки проявляют нестабильность. Образование внехромосомных копий явно представляет собой более частое событие, чем амплификация внутри хромосомы. Мы не знаем, происходит ли внутрихромосомная амплификация менее часто как процесс, происходящий de novo, или она связана с внехромосомной амплификацией, являющейся промежуточной ступенью процесса. Из-за неправильной сегрегации двойных микрохромосом увеличение числа копий может происходить относительно быстро в тех случаях, когда при каждом делении отбираются клетки, содержащие больше, чем положено, копий генов dhfr. Такие клетки возникают и отбираются в ответ на возросшие уровни метотрексата. Поведение двойных микрохромосом объясняет ступенчатую эволюцию признака mtx и нерегулярные колебания в уровне генов в нестабильных линиях. [c.498]

Вокмсжность вести селекцию на амплификацию гена очень удобна в целом ряде случаев. Облегчается клонирование генов, способных к амплификации, а также анализ их структуры в составе хроматина. Однако в данной главе мы ограничимся вопросами, касающимися использования феномена амплификации для осуществления избыточной экспрессии белковых продуктов. Идея заключается в том, что ко-амплификация всех последовательностей рекомбинантной конструкции при селекции на амплификацию генов-маркеров резко усиливает экспрессию любого клонированного в ее составе гена, причем повышение продукции интересующего белка часто оказывается пропорциональныхМ увеличению числа копий гена — по крайней мере до тех пор, пока не будет достигнут. максимально возможный уровень экспрессии. В экспериментах такого рода часто используется ген дигидрофолят-редуктазы в комбинации с мутантными клетками СНО, у которых нет эндогенного фермента. [c.241]

В разд. 8.2 приведены методики первичной селекции и последующей амплификации генов в векторах на основе dhfr, ada, gs и m-mtl. В разд. 8.3 обсуждаются факторы, которые следует учитывать при выборе стратегии амплификации. В разд. 8.4 onsi anbi методы аналг13а амплификации генов. [c.245]

Клоны, резистентные к С(1С12, можно сразу использовать для анализа амплификации генов (методы — см. разд, 8.4), а можно провести еще один цикл селекции при концентрациях Сс1 + от 5 до 50 мкМ. [c.250]

Появление целого ряда различных амплифицируемых векторов, описанных в разд. 8.2, позволило расширить ассортимент клеток, используемых для амплификации генов, и не ограничиваться исходными /г/г -клетками СПО ОИКХ-ВИ. В связи с этим перед исследователем встала проблема выбора клеток и векторной системы. В качестве общего правила можно рекомендовать в первую очередь рассматривать /г/г+-систему, поскольку селекция в с /1/г -клетках СНО обеспечивает высокую частоту трансфекции, а процесс амплификации вектора наиболее полно изучен именно для этих клеток. [c.258]

Спонтанные изменения генетической природы организма — продуцента основаны на процессах рекомбинации генетического материала in vivo (амплификация, конъюгация, трансдукция, трансформация и пр.). Для вьщеления из природных популяций высокопродуктивных штаммов микроорганизмов используют методы селекции, т. е. направленного отбора организмов со скачкообразным изменением геномов. Методы слепого многоступенчатого отбора случайных мутаций чрезвычайно длительны и могут занимать целые годы. Для возникновения мутаций интересующий ген должен удвоиться 10 —10 раз. Более эффективен метод искусственного повреждения генома. Таким методом является индуцированный мутагенез, основанный на использовании мутагенного действия ряда химических соединений (гидроксиламин, нит-розамины, азотистая кислота, бромурацил, 2-аминопурин, алки-лирующие агенты и др.), рентгеновских и ультрафиолетовых лучей. Мутагены вызывают замены и делеции оснований в составе ДНК, а также индуцируют мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания информации. [c.33]

Генетическая инженерия — важнейший прогрессивный способ изменения генетической программы организма в целях создания высокопродуктивных штаммов промьпштенных микроорганизмов. Успехи современной генетической инженерии сушественно влияют на промышленную биотехнологию. Яркий пример больших возможностей генетической инженерии — создание во ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов штамма Е. oli для получения треонина. В результате были изменены не только регуляторные свойства фермента аспартаткиназы, но и питательные потребности штамма. Введение в геном бактерии нового гена обеспечило бактерии возможность использования в качестве источника углерода сахарозу, основного дисахарида традиционного промышленного сырья — свекловичной мелассы. Перечисленные манипуляции наряду с амплификацией плазмид, содержащих оперон треонина, позволили значительно увеличить производительность штамма бактерии и получить за 40 ч ферментации 100 г L-треонина на 1 л культуральной жидкости. Учитывая исключительные способности штамма Е. соН к сверхсинтезу L-треонина, японская фирма Адзиномото приобрела в 1982 г. лицензию на использование российского штамма — продуцента треонина для организации собственного производства. [c.50]

Альтернативные методы скрининга космидных библиотек, описанные в гл. 3, предполагают селекцию космидных клонов с использованием феномена гомологичной рекомбинации in vivo. Остальные главы книги посвящены вопросам, связанным с экспрессией клонированных генов. Для многих белков млекопитающих удалось осуществить высокопродуктивную внутриклеточную экспрессию в Е. oli. Однако гетерологические белки, локализующиеся в цитоплазме, часто образуют трудно растворимые агрегаты, что значительно осложняет получение нативного продукта. В гл. 4 описаны эффективные способы выделения активных растворимых продуктов из нерастворимых белков цитоплазмы Е. соИ. Вероятность деградации специфическими бактериальными протеиназами многих эукариотических белков, синтезируемых в Е. oli, может быть существенно снижена, если их экспрессировать в виде гибридных белков. Такие составные белки, в которых бактериальный компонент обычно представлен -галактозидазой, можно использовать в качестве иммуногенов для получения антисыворотки и моноклональных антител к клонированному эукариотическому белковому домену. Эти вопросы >ассматриваются в двух главах — одна посвящена получению поликлональной антисыворотки, а другая — методам гибридной технологии. В последующих главах книги описаны современные эукариотические экспрессирующие системы в гл. 7 — дрожжевая, далее в трех главах — системы на основе культивируемых клеток млекопитающих и трансгенные животные. В частности, описана система экспрессии с использованием векторов, которые несут гены, обеспечивающие возможность их индуцибельной амплификации это позволяет снимать токсическое действие антибиотиков, введенных в культуральную среду. Клонированные в таком векторе гены также [c.8]

Во всех известных на сегодняшний день случаях не только геномные копии, но и кДНК любого из этих генов в составе экспрессирующего вектора способны к амплификации в трансфицированных культивируемых клетках (см., например, [6—9,11,12]). Следовательно, вряд ли существует некая специфическая последовательность ДНК, ответственная за амплификацию. И хотя механизм этого явления изучен недостаточно полно, можно все-таки предположить, что в ходе селекции происходит лишь фиксирование определенных случайных событий амплификации, возникающих независимо с определенной частотой во всех пролиферирующих клеточных популяциях. Одна из гипотез связывает эти события с ошибками репликации ДНК [2]. С этой гипотезой согласуется наблюдение о том, что амплифицирующиеся участки хромосомной ДНК во всех случаях значительно превышают по размеру собственно кодирующую последовательность фермента (часто амплифицируются фрагменты длиной более 1000 т. п.н.). Точно так же при селекции на амплификацию клонированных генов увеличивается число копий и других последовательностей вектора — они тоже вовлекаются в амплификацию. [c.240]

Можно также использовать амплифицируемый ген как доминантный селективный маркер при трансфекции клеток, способных синтезировать соответствуюш,ий эндогенный фермент. В этих случаях подбирают такую концентрацию токсического веш,ества, которая убивает родительские клетки, но не летальна для трансфицированных клеток из-за повышенного уровня экспрессии фермента. Не все доминантные селективные маркеры можно амплифицировать путем селекции так, бактериальные маркеры neo и gpt (см. гл. 6 книги II данной серии [34]) не удается использовать для селекции на амплификацию, так как для них нет ингибиторов, способных стехиометрически связываться с этими ферментами. Отметим, что все гены животных, перечисленные в табл. 8.1, относятся, по крайней мере потенциально, к доминантным амплифицируемым маркерам. [c.242]

Ген металлотионеина представляет собой еще один амплифицируемый маркер, работа с которым подробно освещена в данной главе. Особенно хорошо изучен один из двух генов мыши m-mtl, этот ген невелик, и его геномную копию удобно клонировать в плазмидных векторах [8]. Попытки использовать данный ген в качестве доминантного селективного маркера окончились неудачей (кроме векторов на основе ВРУ [19]). Поэтому для первичной селекции требуется дополнительный маркерньп ген. Эти недостатки компенсируются в ряде случаев простым и недорогим методом селекции клеток на амплификацию мышиного гена rn-mtl, хотя число копий на клетку в этой системе не превышает 100. [c.244]

Удобный вектор, содержащий мышиный ген mtl, показан на рис. 8.3. Hилie приведена методика селекции на амплификацию векторов с генами neo и mtl в клонах, полученных на основе клеток СП0-К1. [c.249]

В присутствии проведите селекцию устойчивых к 0418 линий клеток. СсЮЬ можно хранить при комнатной температуре в виде концентрированного стерильного раствюра в воде (ЮмМ). Обычно для селекции используют концентрации от 3 до 5 мкМ. Для оценки частоты амплификации эндогенного гена следует обработать нетрансфицированные клетки СН0-К1 темп же концентрациями Сс1С12 и при той же плотности клеточной популяции. Частота такой амплификации может быть значительной при использовании Сс1 + в концентрации 3 мкМ и ниже. [c.250]

Векторы, несущие ген dhfr, имеют то преимущество, что провирусные последовательности можно подвергнуть амплификации путем метотрексатной селекции это позволяет повысить уровень экспрессии и титр вирусных препаратов [21]. Тем пе менее наибольшее распространение в качестве доминантных маркеров получили гены, обеспечивающие селективную лекарственную устойчивость — такие, как neo или hgr. Это объясняется тем, что они хорошо сочетаются со многими клеточными типами и не требуют специальной среды для селекции. Во всех известных конструкциях векторов для спаренных генов ген, расположенный ближе к 5 -LTR, экспрессируется в составе геномного вирусного РНК-транскрипта. Для обеспечения экспрессии более удаленного гена применяют два разных методических приема это либо экспрессия в составе отдельной субгеномной РНК, образующейся в результате сплайсинга вирусной РНК, либо использование внутреннего промотора, введенного в состав вектора. [c.281]

Все рассмотренные выше методы селекции продуцентов биологически активных веществ сегодня, в период интенсивного развития методов генной инженерии, называют традиционными методами. Эти методы в прошедшие 30 лет в огромной мере содействовали созданию микробиологической промышленности антибиотиков, аминокислот, ферментов, витаминов и других практически важных веществ. Исчерпали ли традиционные методы свои возможности Нам кажется, думать так преждевременно, как и надеяться на то, что генная инженерия в ближайшее время сможет быть применена для создания и улучшения обширного круга принадлежащих к разным таксономическим группам продуцентов, которыми располагает сейчас микробиологическая промышленность. Даже более реальная возможность использовать иа основе генноинженерных методов в качестве продуцентов микроорганизмы, для которых эти методы наиболее отработаны, например E sheri hia oli, едва ли удовлетворит промышленность числом продуктов микробного синтеза. В связи с этим очень важно для старых перспективных в промышленном отношении микроорганизмов, помимо совершенствования методов отбора нужного типа мутантов, развивать методы генетического обмена на основе слияния протопластов, трансдукции, трансформации хромосомной и плазмидной ДНК, которые расширяют возможности традиционных методов селекции. Вместе с тем у промышленных микроорганизмов все шире проводится поиск плазмид и предпринимаются попытки их использования в качестве векторов при переносе генетического материала, его клонировании и амплификации. Эти исследования важны для понимания генетического контроля сложных процессов синтеза, таких, иапример, как синтез антибиотиков, для выявления узких мест в биосинтезе многих других продуктов. Одновременно они приближают промышленные микроорганизмы к объектам генной инженерии. Методология генной инженерии постоянно совершенствуется и расширяет свои возможности. В таком успешном встречном развитии разных методов и их слиянии на все большем числе продуцентов можно представить себе ближайшее будущее селекции микроорганизмов, призванной обеспечить промышленность высокопродуктивными штаммами. [c.95]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология