Антитела блоттинг

Иммунный комплекс. Продукт реакции антиген-антитело, который может также содержать в своем составе компоненты системы комплемента. Иммуноблоттинг (вестерн-блоттинг). Метод идентификации белков и определения их свойств с использованием антител. [c.558]

Вестерн-блоттинг. Метод переноса белков на нитроцеллюлозный фильтр с последующей идентификацией интересующего исследователя белка с помощью соответствующего зонда (например, антител). Вставка. Дополнительный фрагмент ДНК, который вводят в исходную молекулу методами генной инженерии. [c.51]

Полосы белков с гелей переносят на нитроцеллюлозную бумагу и окрашивают комплексом серебра. В этих условиях сохраняются антигенные детерминанты и индивидуальный белок может быть обнаружен по реакции со специфическими антителами с использованием блоттинга [416]. [c.312]

Например, если матрица очень стабильна, продукт накапливается в больших количествах даже без повышения уровня транскрипции. Если изучаемый ген не обладает ферментативной активностью, можно получить соответствующие антитела и выявить экспрессию гена с помощью вестерн-блоттинга либо других стандартных иммунологических методов. [c.311]

ИЭФ определяют число дуг преципитации со стандартной смесью антигенов и сравнивают с контрольной антисывороткой (рис. 2.10). Двумерный ИЭФ аналогично ИЭФ (рис. 2.7). Вестерн-блоттинг сравнивают профиль связывания исследуемой и нормальной сывороток со стандартным антигеном. Используют маркеры мол. массы для определения специфичности антител (см. гл. 6). [c.95]

Определяют авидность. Высокая авидность необходима для проведения радиоиммунологического анализа в жидкой (фазе, а также для методов, где важно иметь низкий фон, в том числе для осуществления иммуногистохимических исследований клеток и тканей и Вестерн-блоттинга. Отличительное свойство антител с высокой авидностью заключается в том, что они сохраняют способность оптимально связываться с аи- [c.112]

В гл. 2. Технология конъюгации антител с ферментами (например, пероксидазой хрена, ПХ) описана в кн. 2. Существуют коммерческие препараты конъюгированных с ПХ антител к иммуноглобулинам различных видов животных (см. приложение). На рис. 6.17 приведены результаты Вестерн-блоттинга, полученные при использовании иммуноферментного метода. [c.233]

Рис. 29. Вестерн-блоттинг нативных цитоплазматических (А) и митохондриальных (Б) белков кукурузы (1), пырейника (2), озимой ржи (3) и озимой пшеницы (4) с поликлональными антителами против БХШ 310.

Вестерн-блоттинг нативных митохондриальных белков исследованных злаков с поликлональными антителами против БХШ 310 показал, что, кроме белка 310 кДа, присутствующего в разных количествах у всех исследованных видов, в их спектрах имеется белок с мол. массой около 230 кДа, ряд белков с мол. массами около 140 кДа, а также белки 66 и 56 кДа (рис. 29,Б). [c.59]

А, Вестерн-блоттинг с поликлональными антителами против БХШ 310 Б. Окраска геля бромистым этидием для выявления связанных с белком нуклеиновых кислот. Справа приведены молекулярные массы белков кДа, [c.60]

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ЭПАГ) стал повседневной процедурой для определения компонентов сложных молекулярных смесей. Электрофоретический перенос полосы на нитро-целлюлозную мембрану (Вестерн-блоттинг) обеспечивает возможность не только тестирования специфичности антител, но и позволяет сконцентрировать макромолекулярный иммуноген для последующего введения его животным. Показано, что окрашенные на белок, вырезанные и тонко измельченные по- [c.52]

Иммунологические методы пгароко используются для идентификации мембранных компонентов, их локализации, оценки количества, выделения. Это методы получения поликлональных и моноклональных антител к компонентам мембран, иммуно-блоттинг (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата на рия с перенесением разделенных белков на нитроцеллюлозные фильтры для последуюп] его выявления с по- [c.202]

Рис. 4. Электрофорез в ПААГе с ДДС-Na (А) и вестерн-блоттинг с антителами на дегидрины и RAB (Б) термостабильных белков, накапливающихся в узлах кущения растений озимой пшеницы в период осенней адаптации.

Наиболее простой путь для преодоления этой проблемы- предварительное разделение активностей NPT-II и АТРазы. Для этого разработан ряд методов, наиболее удобный из которых основан на фракционировании с помощью неденатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле [46]. Из исследуемого материала на холоду в присутствии смеси ингибиторов протеиназ готовят бесклеточные экстракты и фракционируют их методом электрофореза. Гель, содержащий фракционированный экстракт, вынимают из прибора и уравновещивают соответствующим буфером, который используют для проведения реакции. Фермент затем должен взаимодействовать с кофакторами и субстратами это достигается путем иммобилизации их в слое агарозы, плавящейся при низких температурах. На поверхность акриламидного геля наливают агарозу, и она застывает. Реакцию проводят, как и в обычной жидкой фазе, и образующийся в результате фосфорилированный канамицин переносится затем с геля на лист фосфоцеллюлозной бумаги посредством капиллярных сил, как при блоттинге по Саузерну. Бумагу затем npoj мывают, как описано выще, но в данном случае радиоактивный канамицин выявляют радиоавтографией. Судя по сообщениям, чувствительность данного метода позволяет в оптимальных условиях (чистый препарат фермента) обнаружить 1 нг активного фермента, но значительно снижается при использовании неочищенных препаратов. Известен и другой метод определения NPT-II с помощью специфических антител и вестерн-блоттинга (разд. 6.8). [c.347]

Вестерн-блоттинг — это исключительно чувствительный аналитический метод. С его помощью в грубом белковом экстракте можно выявить до 50 нг антигена, а в более чистых препаратах и еще меньшие количества. Хотя здесь метод вестерн-блоттинга описан как альтернативный анализу in situ для выявления экспрессии NPT-II в трансформированных тканях (разд. 6.7.3), приведенные ниже методики можно оптимизировать для исследования многих других белков. Хорошим примером служит работа Джонниса с сотрудниками [29], где с помощью моноклональных антител к фитохрому изучали молекулярные механизмы участия фитохрома в фотоморфогенных ответах. [c.358]

В данном разделе метод вестерн-блоттинга используется для выявления экспрессии гена npt-II в трансформированных клетках моркови [50]. Антитела к NPT-П получали из сыворотки кролика, при этом животных иммунизировали ферментом, выделенным из Е. oli с помощью стандартных методов работы с белками (ионообменная [35] и аффинная [15] хроматография). Показано, что NPT-П выявляется в виде одной иммуно-реактивной зоны, обладающей той же электрофоретической подвижностью, что и исходный бактериальный фермент. Эти результаты позволяют сделать ряд заключений об экспрессии фермента в клетках растений трансляция мРНК гена nos-npt-II в [c.358]

С помощью одних и тех же антисывороток перекрестный ИЭФ позволяет выявить большее число антигенов, чем простой ИЭФ. Дополнительное преимущество — это возможность очистки антигенов. Наибольшая ценность перекрестного ИЭФ заключается в том, что он позволяет определять специфичность антител в неденатурирующих антигены условиях. В то же время электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии ДСН с последующим Вестерн-блоттингом и иммунохимиче-ским окрашиванием хотя и обладает очень высокой чувствительностью, однако позволяет обнаружить только те антигенные эпитопы, которые не изменяются после денатурации. [c.228]

Молекулы, разделенные с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, можно электрофоретически перенести на нитроцеллюлозную мембрану, с которой они свяжутся, воспроизведя картину элекрофоретического разделения. Этот процесс называют Вестерн-блоттингом или электроблоттингом [10, 17]. После блоттинга треки стандартного антигена и маркеров мол. массы окрашивают белковым или углеводным красителем, а остальные. инкубируют с образцами антител 9, 18]. С помощью меченых антител выявляют отдельные антигенные полосы (после электрофореза в. восстанавливающих условиях — субъединицы сложных молекул антигенов). Эту стадию называют иммунохимическим окрашиванием. В полном варианте метода используют как исключительную способность электрофореза в ПААГ разделять молекулы, концентрации которых очень малы, так и свойство антител выявлять специфические антигенные компоненты. Таким образом, метод чаще всего применяют для определения состава и молекулярных размеров антигенов, но, кроме того, он очень эффективен для определения специфичности антител (в частности, МКА) и поиска антигенно родственных молекул в однотипных или раз-лич.ных антигенных препаратах (например, различные виды бактерий, вирусные мутанты, клеточные экстракты и т. д.). [c.230]

При демонстрации связывания МКА с репликой антигена необходимо быть уверенным в специфичности конъюгата. Каждое моноклональное антитело имеет определенный изотоп. Для окрашивания реплики можно применять антитела, реагирующие со всеми изотипами мышиных иммуноглобулинов, одиако такую специфичность следует подтвердить с помощью ELISA, используя для связывания с лунками паиели чистые препараты всех изотипов. Другой способ — проверить набор МКА всех изотипов с помощью Вестерн-блоттинга. [c.235]

Для изучения гликолипидных антигенов чрезвычайно полезным оказался впервые описанный Маньяни и соавторами (Mag-nani et al., 1980) элегантный метод, представляющий собой комбинацию ТСХ и РИА. При использовании этого метода хроматограмму сначала инкубируют с моноклональными антителами, а затем с меченными антителами против IgG мыши. Обладающие антигенной активностью липиды выявляют с помощью радиоавтографии отмытой и высушенной хроматограммы (рис. 9-3). В сходном методе (Towb,in et al., 1984) липиды переносят блоттингом с хроматограммы на нитроцеллюлозный фильтр, который затем обрабатывают антителами таким же образом. С помощью этого метода можно выявлять антигены в количестве до нескольких нанограммов, т. е. его чувствительность на два порядка выше чувствительности, достигаемой при химическом детектировании с использованием паров иода и красящих реагентов. Не все виды покрытых силикагелем пластин для ТСХ одинаково пригодны для иммунологического выявления липидов. Слой силикагеля должен быть достаточно прочно связан с подложкой и не должен сходить с неё при обработке пластины водными буферными растворами. [c.167]

Системы на основе с-тус-последовательностей. Мышиные моноклональные антитела 9Е10 к белку с-тус широко использу-К)тся в качестве иммунохимического реагента в клеточной биологии и белковой инженерии [165]. Эпитоп, распознаваемый антителами, который представляет собой последовательность из 11 аминокислотных остатков, может быть экспрессирован в составе различных белков и остается распознаваемым антителами. Эта аффинная метка используется в Западном блоттинге, для иммунопреципитации белков, в проточной цитометрии, а также для мониторинга экспрессии генов на уровне трансляции в бактериальных и эукариотических системах, в том числе, и для быстрой очистки рекомбинантных белков, которые могут быть закристаллизованы 166, 167]. Система часто используется для обнаружения рекомбинантных белков, но редко - для их выделения в чистом виде. [c.129]

Рис. 28 Вестерн-блоттинг цитоплазматических полипептидов контрольных (1) и стрессированных при -1 0 (2) проростков гороха, контрольных (3) и стрессированных при 0°С (4) проростков тыквы, контрольных (5) и стрессированных при -1°С (6) проростков подсолнечника и субъединиц БХШ 310 озимой ржи (7) с поликлональными антителами против БХШ 310.

При селективном исследовании с использованием первичных антител против богатой лизином области дегидринов библиотеки кДНК, созданной из закаленных тканей коры персика, было обнаружено, что некоторые клоны обладают высокой степенью сходства с дегидринами. Нозерн-блоттинг с использованием клона 5А показал, что 1,8 кЬ участок экспрессировался сезонно и в листопадных, и в вечнозеленых генотипах, а таьсже индуцировался водным дефицитом. Вечнозеленые и листопадные [c.31]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология