Хроматина электрофорез

Рис. 10.13. Гель-электрофорез как инструмент исследования хроматина.

Простой диагностический тест на присутствие нуклеосом был разработан на основе данных о том, что ДНК в хроматине организована в регулярно повторяющуюся структуру. Если выделенные ядра или хроматин обработать нуклеазой микрококков (или в некоторых случаях просто выделить и обработать экзогенным ферментом), ДНК расщепляется на интегральное множество единиц длины. При этом в результате фракционирования методом электрофореза в геле образуется лестница , пока- [c.361]

Электрофорез образцов ДНК показан в нижней части рисунка. Каждая фракция образует полосу ДНК определенного размера. Отдельные полосы соответствуют определенным ступеням лестницы, полученной в результате расщепления хроматина. (Справа на фотографии представлена для сравнения лестница .) Нуклеосомы- [c.361]

Если расположение нуклеосом на ДНК происходит случайным образом, то все сайты, чувствительные к нуклеазе микрококков, рано или поздно окажутся в линкерной области, став доступными для действия фермента. Картина расположения полос при расщеплении хроматина и ДНК будет одинаковой. Но, если нуклеосомы лежат в упорядоченных местах (фазированы), некоторые сайты, чувствительные к нуклеазе микрококков, будут вне пределов досягаемости, так как окажутся в пределах минимальной нуклеосомы. Тогда отдельные полосы, обнаруживаемые при электрофорезе расщепленной ДНК, будут отсутствовать в электрофореграммах расщепленного хроматина. Если же при образовании нуклеосом возникают новые чувствительные сайты, то в электрофореграммах расщепленного хроматина можно будет обнаружить новые полосы. Таким образом, различие в расположении полос при расщеплении контрольной ДНК и хроматина доказывает существование фазирования нуклеосом. Такие эксперименты действительно были выполнены. [c.379]

Некоторые активированные рецепторы, связавшись с хроматином, регулируют транскрипцию определенных генов. Однако лишь немногие гены в любой клетке-мишени находятся под прямым влиянием стероидных гормонов. Напримф, через 30 мин после добавления кортизола к культуре печеночных клеток крысы из тысячи белков, которые можно разделить с помощью двумерного гель-электрофореза, затронутыми оказываются всего семь количество шести из них увеличивается, а количество одного падает. После удаления гормона скорость синтеза этих белков возвращается к норме. Предполагая, что указанный метод позволяет выявить около 10% клеточных белков. [c.257]

Основные белки хроматина, гистоны, растворимы в кислой среде и легко образуют агрегаты, поэтому для исследования этих белков были разработаны специальные методы, например методы с применением электрофореза в свободной среде [290] или на бумаге [572]. Однако наилучщие результаты были получены при электрофорезе в крахмальном геле [638, 1248, 1249], на полосках ацетата целлюлозы [793] или в полиакриламидном геле. [c.306]

Негистоновые белки хроматина обычно исследуют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН. Одни иа-этих белков обладают, очевидно, тканевой специфичностью [1088, 1461], тогда как другие представляют собой, вероятно,, ферменты, имеющие общие для всех тканей структурные компоненты [337]. [c.307]

Обработку цетавлоном удобно использовать для диссоциации белков от ДНК в хроматине с одновременным осаждением ДНК и последующим электрофорезом комплексов белков с- цетавлоном. При низких значениях pH связывание цетавлона с ги-стонами и негистоновыми белками хроматина носит избирательный характер, что способствует их электрофоретическому разделению. [c.86]

Кроме ферментов в ядрах содержатся негистоновые белки, имеющие, по-видимому, отношение к структуре хроматина. К ним относятся так называемые H.MG-белки, принадлежащие к двум классам HMQ 14 и 17 и H.MG 1 и 2. (Название H.MQ-белков происходит от англ. high mobility group — группа [белков с высокой подвижностью, так как в обычных системах гель-электрофореза эти белки движутся быстрее других негистоновых белков хроматина.) Эти белки содержат много положительно и отрицательно заряженных аминокислотных остатков, причем они располагаются асимметрично iV-концевая часть богата кислыми остатками, а С-концевая — основными. Возможно, HMG-белки участвуют в процессах транскрипции и репликации. [c.238]

Моно- и ОЛИ ногу клеосомы можно выделить, например, центрифугированием в градиенте сахарозы продуктов расщепления хроматина нуклеазой. Еще более тонкое фракционирование хро-матиновых частиц получают с помощью гель-электрофореза, при котором разделяются нуклеосомы с разной длиной линкера или различающиеся по белковому составу. [c.244]

Регуляторные ДНК-связывающие белки прокариот вызывают заметные изменения конформации ДНК. При рентгеноструктурном исследовании комплекса регуляторного белка TFIHA со своим участком ДНК оказалось, что двойная спираль находится в А-форме. Другие изменения (изгибы и изломы двойной спирали) можно обнаружить с помощью электронной микроскопии, электрофореза ДНК-белковых комплексов, а также при действии нуклеаз. Связанный белок защищает от расщепления 15—30 п. о. в месте связывания и порождает два участка повышенной чувствительности к нуклеазам с обеих сторон от места связывания. Тонкий анализ мест гиперчувствительности в хроматине эукариот показал, что они имеют точно такую же структуру — две гипер-чувствительные точки, разделенные защищенны.м участком. [c.257]

Рис. 126. Электрофорез фрагментов ДНК, образовавшихся при расщеплении микрококковой нуклеазой хроматина печени крысы (левая дорожка) и гриба неироспоры (правая дорожка)

В ядрах клеток всех эукариотов ДНК присутствуют в виде ассоциатов с гистоновыми белками. Эти ассоциаты, или хрома-тиновые фибриллы, представляют собой надмолекулярную структуру, повторяющимся элементом которой является частица, называемая нуклеосомой. Каждая нуклеосома состоит из восьми гистонов (по две молекулы гистонов Н2А, Н2В, НЗ и Н4) и включает участок намотанной на этот белковый октамер нити ДНК длиной в 140 нуклеотидных пар. Продолжение этой нити образует перемычку со следующей нуклеосомой. В зависимости от т ого, какому организму или какой ткани этого организма принадлежит данная клетка, перемычка между нуклео-сомами может содержать от О (дрожжи) до 100 (сперма морского ежа) нуклеотидных пар. Стафилококковая нуклеаза расщепляет молекулу ДНК в области перемычек с образованием фрагментов, длина которых кратна длине участка ДНК, входящего в состав нуклеосомы [136]. После отделения от белков эти фрагменты можно разделить с помощью электрофореза в агарозном геле и таким образом обнаружить различия в структуре повторяющегося звена хроматина (рис. 10.13, Л). При обработке хроматина ДНКазой I нуклеосомальная ДНК расщепляется на фрагменты, содержащие в среднем 10,4 нуклеотидных пар (я —целое число) [137]. Эти сравнительно более короткие фрагменты ДНК можно разделить с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (рис. 10.13, ). [c.193]

Изучение кинетики расщепления хроматина нуклеазами и анализ смеси образующихся продуктов с помощью гель-электрофореза по-прежнему остаются основными подходами к выяснению структурной организации нуклеопротеидов ядер эукарио-. [c.193]

Б — электрофорез фрагментов ДНК, полученных путем расщепления хроматина эритроцитов цыпленка с помощью ДНКазы I, в пластинке 10%-ного полиакриламидного геля содержащего 40 мМ трис, 20 мМ NaOA , 2 мМ ЭДТА и 7М мочевину (pH 7,8). Ступенчатый характер полученной картины разделения обусловлен те.ч, что ДНКаза I расщепляет нуклеосомальную ДНК на фрагменты, различающиеся по длине на 10 нуклеотидных пар. (Дж. Аллан, неопубликованные результаты.) [c.194]

Рис. 29.4. Нуклеаза микрококков расщепляет ядерный хроматин на мультимерные серии отрезков ДНК, которые можно разделить с помощью электрофореза.

В то время как молекулярная масса гистонов не превышает 40 000 [117, 118], негистоновые белки хроматина (по данным электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН) характеризуются большой молекулярной массой (до 180 000) [1282]. [c.307]

Было осуществлено [790] двухмерное разделение негистоно-вых белков хроматина (ИЭФ в присутствии мочевины в первом направлении и электрофорез в полиакриламидном геле с ДСН во втором). Авторы обнаружили, что изоэлектрические точки этих белков лежат в интервале pH 2—6, а молекулярная масса составляет 15 000—200 000. По-видимому, лишь некоторые из этих белков обладают тканевой специфичностью [1250]. [c.309]

Естественно, что после открытия нуклеосом мы вновь вернулись к вопросу о месте гистона Н1 в структуре хроматина. В. В. Бакаев и А. Я. Варшавский проверили, су-ш,ествуют ли нуклеосомы в препаратах хроматина, лишенных гистона Н1, т. е. в ДНПо,б, и обнаружили их там. Далее они разработали новый подход к фракционированию нуклеосом — электрофорез в полиакриламидном или агарозном геие в неденатурирующих условиях при низкой ионной силе. При агарозном электрофорезе хорошо разделяются MOHO-, ди- и тринуклеосомы, гораздо лучше, чем при ультрацентрифугировании в сахарозном градиенте. Более того, каждый из компонентов, в свою очередь, дает по нескольку полос (рис. 13). [c.88]

Сразу возникло предположение, что энзиматические модификации гистонов могут влиять на структуру хроматина и на его активность. Действительно, при фосфорили-ровании лизина происходит замена одного положительного заряда в гистоне на отрицательный, при ацетилиро-вании — утрата положительного заряда и т. д. Именно благодаря таким изменениям в заряде модифицированные гистоны можно отделить от немодифицированных при проведении гель-электрофореза в ацетатном буфере с мочеви- [c.153]

Белки HMG могут участвовать в организации активного хроматина [160—166]. Помимо гистонов, хроматин содержит множество негистоновых белков, функция которых не известна. Среди них, очевидно, должны быть структурные белки, ферменты, обеспечивающие протекание процессов репликации, транскрипции и др., и регуляторные белки. Э. Джонс (Великобритания) попытался выделить белковые компоненты, присутствующие в достаточно большом количестве, что позволило бы провести их анализ и идентификацию. Ему действительно удалось изолировать новый класс ядерных белков, названный им группой белков с высокой подвижностью (high mobility group), или HMG-белки. Название зависело от высокой подвижности этих белков при электрофорезе в геле. Фракция HMG-белков распадается на ряд индивидуальных компо- [c.156]

Основной эксперимент заключался в следующем. Выделенные мини-хромосомы вируса SV40 обрабатывали топо I, затем выделяли из контрольных и обработанных ферментом мини-хромосом ДНК и сравнивали их с помощью высокоразрешающего электрофореза в агарозном геле, при проведении которого происходит разрещение топоизомеров ДНК, т. е. две одинаковые ДНК, различающиеся всего на один супервиток, видны как две разные дискретные полосы. Оказалось, что ДНК, выделенные из обработанных топо I и контрольных мини-хромосом, содержат одинаковые наборы топоизомеров, обе негативно закручены и вообще неразличимы между собою. Следовательно, топо I не вносила изменений в ДНК, когда последняя была в составе мини-хромосомы. Отсюда вытекает, что ДНК в составе хроматина находится в равновесном, энергетически наиболее выгодном состоянии, и упругие торзионные напряжения в ней отсутствуют. [c.175]

Электрофорез хроматина. Электрофоретическое фракционирование хроматина после его обработки микрококковой нуклеа-зой ведут в буфере низкой ионной силы, например в 0,01 М три-этиламмоний-НС1 (pH 7,6 2 мМ ЭДТА), что обусловлено плохой растворимостью хроматина в более концентрированных буферах. Хроматин в целом (благодаря ДНК) заряжен отрицательно и мигрирует к аноду. Удается разделить субнуклеосомы, моно-нуклеосомы с различным содержанием ДНК и белков, лежащих вне их ядра ( соге ), а также ди- и трииуклеосомы. Ввиду малой электропроводности разбавленного буфера при напряженности 15 В/см сила тока через трубку диаметром 6 мм составляет всего лишь 3 мА. Электрофорез в трубках длиной 7 см занимает 1,5 ч. [c.56]

Электрофорез белков в комплексе с ДДС-Na был успешно использован для фракционирования белков хроматина без их предварительной очистки. Хроматин диализовали в течение 12 ч против 0,01 М Na-фосфата с 1% ДДС-Na и 1% р-меркаптоэта-нола при комнатной температуре, а затем еще 12 ч —против свежей порции такого же раствора при 37°. Только после этого его прогревали в течение 3 м-ин при 100° и диализовали еще [c.65]

Апоптоз клеток в тимусе. 1. К долькам тимуса плода в тканевой культуре добавляли антитела анти-СОЗ, в результате чего при участии ТкР происходила активация клеток и включался механизм их запрограммированной гибели (апоптоз). На электронной микрофотографии видно, что в отличие от ядер нормальных клеток (Н), в которых хроматин диспергирован, в ядрах апоптотических клеток (А) наблюдается выраженная конденсация хроматина. (Фото любезно предоставлено д-ром С. Smith.) 2. Анализ ДНК апоптотических клеток методом электрофореза в агарозном геле видна характерная лесенка из фрагментов расщепленной ДНК. [c.224]

Вы изучаете структуру хроматина из клеточных ядер печен крысы. Проведя кратковременную обработку ядер микрококково нуклеазой, затем вьщеление ДНК и электрофорез ДНК в агароз ном геле, вы получаете лесенку из широких полос с регулярнык интервалом, ширина которого соответствует разнице в длив между фрагментами примерно в 200 нуклеотидов. Если вмеси микрококковой нуклеазы использовать ДНКазу I, то на гел появляется растянутая зона шлейфа, на котором слабо видт полосы фрагментов, различающихся по длине на 200 нуклеотидш Если же перед нанесением на гель денатурировать ДНК, обрабо танную ДНКазой I, то образуется иная лесенка из полосн регулярным интервалом, соответствующим разнице в 10 ну леотидов. [c.134]

Вы выделяете хроматин из дрожжей дикого типа и из дрожжей, несущих отдельные плазмиды. Затем кратковременно обрабатываете эти препараты хроматина микрококковой нуклеазой, после чего депротеинизируете ДНК и обрабатываете ее нуклеазой BamHI, которая разрезает ДНК лишь в одном месте-в области центромеры (рис. 9-8). ДНК, обработанную таким образом, вы фракционируете с помощью гель-электрофореза и затем анализируете методом блот-гибридизации, используя в качестве зонда фрагмент радиоактивно меченной ДНК центромеры (рис. 9-8). Этот метод, называемый непрямое мечение концов , позволяет выявить все фрагменты ДНК, начиная с ДНК, расположенной непосредственно справа от участка расщепления ферментом BamHI. Контрольный опыт состоит в том, что вы депротеинизируете препарат хроматина, чтобы получить чистую ДНК, обраба- [c.135]

Другая подгруппа регуляторных белков, также локализованная в хроматине ядра клетки,—иегистоновые белки. Они изучены в гораздо меньшей степени, чем гистоновые. Эти белки крайне гетерогенны, так как при их фракционировании методами электрофореза и изоэлектрофокусирования в полиакриламидном геле обнаружено около 500 полипептидов с молекулярными массами от 5000 до 200000 Да. Некоторая часть негистоновых белков активно участвует в дерепрессии генома, препятствуя образованию суперспирализован-ной ДНК на тех ее участках, где они присоединились в 8-периоде цикла деления клетки. [c.85]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология