Электрофорез в двухмерное разделение

Рис. 12.26. Способ переноса образца при двухмерном разделении методом высоковольтного зонного электрофореза на бумаге [82].

Фнг. 21. Двухмерное разделение аминокислот методом электрофореза (по Гроссу [14]). [c.50]

Если электрофорез направлен перпендикулярно движению растворителя, то можно таким образом осуществить своеобразное двухмерное разделение веществ. [c.294]

Электрофорез в пластинах геля можно проводить в вертикальном или горизонтальном положении. Этому методу посвящено значительное число работ [12, 1061, 1069, 1427]. Он используется также для двухмерного разделения белковых смесей [1, 129, 654, 765, 1062, 1102]. [c.105]

Изотахофорез можно также проводить на полосках из ацетата целлюлозы [1349] и сочетать с классическим электрофорезом в опытах по двухмерному разделению [1188, 1351, 1352]. [c.171]

Для препаративного фракционирования в ПААГ существует 2 типа оборудования колонки, наполненные гелем, и большие пластины. Препаративное разделение белков в слое геля с использованием больших пластин является более удобным и более эффективным. Оно позволяет на одной пластине анализировать одновременно большое число образцов, а также пластины можно приспособить и для двухмерного разделения. Для этого пробу вначале фракционируют в гелевом столбике диаметром 4 мм, а затем этот гель вдавливают в верхнюю часть пластины со слоем геля и подвергают электрофорезу в перпендикулярном направлении. [c.258]

В сочетании с хроматографией ТСЭ очень удобен для двухмерных разделений, когда после электрофореза в перпендикулярном ему направлении проводят хроматографирование. Такой метод, известный под названием метода отпечатков пальцев , дает неоценимую возможность охарактеризовать гидролизаты белков и нуклеиновых кислот. Тонкослойные носители, подобные тем, которые описаны выше, используются и для разделения при высоких напряжениях. [c.122]

Для лучшего разделения соединений с близкими значениями R , а также для увеличения часто проводят хроматографирование в нескольких (обычно двух) системах растворителей, пропуская второй растворитель в том же направлении, что и первый. Это приводит к уплощению пятен разделяемых соединений в направлении, перпендикулярном пропускаемому растворителю, и способствует их лучшему разделению. Более полное разделение аминокислот и пептидов достигается при двухмерной хроматографии (второй растворитель пропускают в направлении, перпендикулярном первому) или при сочетании хроматографии (одно направление) и электрофореза (второе взаимно перпендикулярное направление). Последний метод носит название метода пептидных карт или отпечатка пальцев . [c.126]

В плане этих общих подходов электромиграционный метод близок к хроматографии (те же два основных направления повышения эффективности разделения) — поиск методических приемов лучшего разрешения зон при постоянных Кс и использование химических превращений с целью увеличения Кс. Похожи и основные схемы практического осуществления процесса разделения на колонке, на бумаге, в тонком слое. Возникший на заре развития электромиграции метод подвижной границы внешне аналогичен фронтальному анализу в хроматографии. В этом случае движение разделяемых ионов в электрическом поле происходит непосредственно из раствора их смеси. В наиболее распространенном случае зонного электрофореза просматривается общность с проявительным режимом элюирования в хроматографии. Узкая полоса исходной смеси веществ в среде определенного электролита разделяется на индивидуальные зоны. Существует внешняя аналогия противоточного и двухмерного электромиграционного разделения с соответствующими способами осуществления хроматографического процесса. Поэтому при всем принципиальном различии методов по природе химических процессов, лежащих в их основе, хроматографию и электрофорез иногда даже рассматривают как смежные методы [95]. [c.243]

В крахмальном геле можно работать при pH от 2 до 11. Этим методом были изучены многие белковые смеси, прежде всего сыворотка крови и гемоглобины. Основные результаты этих работ можно найти в обзорах [43, 44]. Как уже говорилось, в сыворотке крови крахмальный гель позволяет обнаружить до 30 компонентов это количество столь велико, что до сих пор не установлено, какую сыворотку считать нормальной , так как у каждого животного и человека имеются индивидуальные, генетически детерминированные отличия. При сравнении с данными электрофореза на бумаге следует помнить, что порядок расположения компонентов в геле может быть совершенно иным. Кроме того, электрофореграмма в геле, вообще говоря, неаддитивна благодаря влиянию одних компонентов на подвижность других, так как присутствие белков в высокой концентрации в узких зонах приводит к локальным изменениям проводимости, pH и вязкости среды иногда наблюдается и прямое взаимодействие белков. Для сопоставления с результатами электрофореза сыворотки крови на бумаге применяют так называемый двухмерный электрофорез. В этом случае сыворотку сначала разделяют на бумаге. После этого зоны не фиксируют, а влажную бумагу прижимают к поверхности крахмального геля и проводят дополнительный электрофорез в геле в перпендикулярном направлении. Лишь после этого зоны проявляют. Этот метод позволяет еще более улучшить разделение. [c.97]

Как можно видеть из схем В я Д (см. фиг. 18 и 19), наилучшее разделение аминокислот получается при электрофорезе в двух направлениях при различных значениях pH. Результаты такого опыта можно сравнить с разделением аминокислот методом двухмерной хроматографии на бумаге. На фиг. 21 и 22 приведены результаты двухмерного электрофоретического разделения аминокислот, полученные Гроссом [14]. При проведении электрофореза в одном направлении при pH 2,0 с последующим кратковременным электрофорезом во втором направлении при pH 9,2 удалось добиться полного разделения 28 аминокислот менее чем за 1 час. После разделения в первом направлении в 0,75 М муравьиной кислоте бумагу высушивают в течение 10 мин при 90° и далее в течение 1 час в струе холодного воздуха для удаления почти всей муравьиной кислоты бумагу вырезают и слегка опрыскивают из пульверизатора 0,05 М. раствором бората натрия при электрофоретического разделе- [c.52]

Как следует из предыдущего обсуждения, эффективность электрофоретического разделения зависит от многих факторов, в том числе от суммарного заряда молекул, ситового эффекта используемого для электрофореза носителя, присутствия денатурирующих агентов и т. п. Благодаря такой вариабельности электрофорез обладает исключительно высокой разрешающей способностью. Однако при исследовании сложной смеси, состоящей из многих белков (а такие исследования приходится проводить довольно часто) некоторые белковые зоны могут перекрываться. В подобных случаях электрофорез во втором направлении может привести к более полному разделению анализируемых веществ, и этот принцип лежит в основе методов двухмерного электрофореза. [c.227]

Электрофорез в первом направлении проводят обычным способом, а затем полученную электрофореграмму используют без фиксации и окрашивания в качестве стартовой зоны для электрофореза во втором направлении, перпендикулярном первому. Если оба этапа электрофореза осуществляют в идентичных условиях, то скорость миграции белков в обоих направлениях одинакова и зоны разделенных молекул располагаются по диагонали. Очевидно, что такие системы улучшают разделение лишь постольку, поскольку оно зависит от удлинения пути миграции разделяемых белков. Чтобы повысить разрешение в значительной степени, необходимо на втором этапе изменить по крайней мере один из электрофоретических параметров. В настоящей главе приводится краткое описание некоторых методов двухмерного электрофореза. Несколько дополнительных вариантов обсуждаются в главах, посвященных разделению определенных классов белков, в частности белков жидкостей тела, рибосомных и мембранных белков. [c.227]

Был описан также метод двухмерного электрофореза, осуществляемого в обоих направлениях на одной пластине геля, Вейн [1391] проводил такой электрофорез в сигмоидном вогнутом градиенте концентрации полиакриламидного геля. Для его формирования использовали квадратную ячейку, в которую гелеобразующий раствор наливали с одного угла этой ячейки. В противоположный угол наносили образец и затем проводили электрофоретическое разделение в двух перпендикулярных направлениях. [c.230]

Ясно, что заранее трудно сказать, какая из разновидностей двухмерного электрофореза даст наилучшие результаты при разделении той или иной сложной смеси белков. Однако, зная основные принципы электрофоретических методов и некоторые характеристики белков разделяемой смеси, можно довольно хорошо подобрать систему, пригодную для разделения большинства компонентов. В дальнейшем же на основании результатов предварительных опытов электрофоретическая система может быть еще более усовершенствована. [c.234]

Наилучшее разделение рибосомных белков было достигнуто при использовании методов двухмерного электрофореза. В этих методах вначале проводят электрофорез в цилиндрическом геле, который затем помещают в аппарат, где формируют пластину второго геля. Белки, разделенные в первом направлении, подвергают электрофорезу в направлении, перпендикулярном оси цилиндрического геля. Для получения хороших результатов необходимо при разделении во втором направлении изменить либо заряд белков, либо ситовые свойства геля, либо оба этих параметра. [c.312]

Хата и Нагаи [524] предложили использовать для разделения компонентов смеси гликозаминогликанов двухмерный электрофорез на листах ацетата целлюлозы (рис. 127). [c.396]

Сочетание тонкослойных электрофореза и гель-фильтрации служит удобным методом исследования труднодоступных объектов, поскольку таким способом можно анализировать образцы, содержащие 10—50 мкг белка. При анализе этим методом лио-филизованные препараты гормона роста человека [50] оказались явно гетерогенными (рис. 6). Портер и сотр. [73] применяли двухмерное разделение в тонком слое сефадекса 0-150 при исследовании связывания гепарина белками плазмы было [c.269]

Для двухмерного разделения веществ применяли также аналитический электрофорез в тонких слоях геля сверхтонкого се-фадекса в сочетании с гельфильтрацией [513]. [c.50]

Было осуществлено [790] двухмерное разделение негистоно-вых белков хроматина (ИЭФ в присутствии мочевины в первом направлении и электрофорез в полиакриламидном геле с ДСН во втором). Авторы обнаружили, что изоэлектрические точки этих белков лежат в интервале pH 2—6, а молекулярная масса составляет 15 000—200 000. По-видимому, лишь некоторые из этих белков обладают тканевой специфичностью [1250]. [c.309]

Все методы, включающие на втором этапе электрофорез в геле с ДСН, дают возможность определять молекулярные массы белков, присутствующих в разделенных зонах. Другой подход к определению молекулярных масс рибосомных белков описали Бикль и его сотрудники [119, 120]. После двухмерного разделения рибосомных белков в системе без ДСН центральную часть каждой зоны вырезают, белки элюируют буферо м, содержащим 6 М мочевину и 1 % ДСН, и подвергают их электрофорезу в геле с ДСН. [c.314]

Определение различий в молекулах Г. производят путем комбинированного применения хроматографии и электрофореза иа бумаге для разделения нептидов, получаемых при непо1[ном ферментативном гидролизе Г. пептиды разных Г., положение к-рых на двухмерной хроматограмме не совпадает, выделяют, определяя затем последовательность аминокислот в этих отрезках (метод дактилограмм и.ди отпечатка пальцев ). Небольшие отклонения в строении белкового компонента Г. заметно сказываются на физич., физико-химич., химич. и биологич. свойствах Г. [c.419]

Высокоэффективным методом разделения является сочетание электрофореза на бумаге с обычной хроматографией. При этом сначала через влажную бумагу, на которую нанесена смесь, пропускают ток высокого напряжения, а затем смесь хроматографируют с помощью подходящего растворителя в направлении, перпендикулярном направлению электрофореза. В результате достигается разделение первоначальной смеси в двух измерениях. Применение такого метода к продуктам ферментативного расщепления белков позволяет получить двухмерную картину, которую называют пептидной картой. Каждый белок дает характерную для него при каждом конкретном способе расщепления картину. Локализацию отдельных компонентов во многих случаях определяют с помощью специфических красителей. При определении аминокислот и пептидов в качестве такого красителя используют, например, нингидрин. Если производится элюция адсорбированных компонентов, то удобнее всего устанавливать их присутствие в элюате спектрофотометрически. Вероятно, наиболее тонким методом разделения белков следует считать иммуноэлектрофорез, при котором эффект достигается за счет использования различий в двух свойствах электрофоретической подвижности и иммунологической специфичности. [c.220]

Изоэлектрическое фокусирование в геле имеет определенные преимущества по сравнению с ИФ в среде со стабилизованным градиентом плотности. Эти преимущества состоят в следующем 1) сокращается длительность разделения 2) полностью подавляется термическая конвекция 3) применяется простое оборудование для ИФ 4) возможно одновременное разделение нескольких образцов 5) возможно обнаружение с помощью различных красителей и различных методик 6) возможно объединение ИФ и зонного электрофореза в двухмерном варианте 7) достаточно небольшого количества образца 8) возможно обнаружение белков методом иммунодиффузии. Однако при применении геля возникают проблемы, связанные с молекулярноситовым эффектом, который имеет место в основном при разделении больших молекул. Другой недостаток метода — это низкая точность определения pH в зонах. В настоящее время этот метод (сокращенное обозначение ИФПАА или ПАГИФ) является общепринятым и широко используется. В отдельных случаях, согласно данным [73], при проведении дискретного трубчатого электрофореза в полиакриламидном геле доо пска-ется окрашивание. Для снижения молекулярно-сито<вого эффекта рекомендуется [23] концентрация геля 3,7%. Типичный градиент напряжения для 8-часового разделения составляет 200 В на 60 мм. Если тепло отводится, то напряжение можно увеличить и соответственно сократить длительность разделения. Градиент pH можно измерить после разрезания столбиков с гелем и последующего элюирования сегментов небольшим коли- [c.323]

Когда еще не было приборов для двухмерного электрофореза (по Гроссу), удовлетворительные результаты получали сочетанием электрофореза с хроматографией. Диксон и др. [15] проводили электрофорез при pH 3,6 с последующим хроматографированием на бумаге в другом направлении с растворителем н-пропанол—пирофосфатный буфер. Лист бумаги ватман № 3 Т-образной формы с размерами, указанными на фиг. 23, свертывают до горизонтальной части т. Последнюю увлажняют с обоих концов буфером пиридин — уксусная кислота, pH 3,6, и проводят электрофорез при 1500 в в течение 20 мин. Диксон и др. применяли прибор Михля с жидким теплоносителем, но столь же успешно может быть использован прибор для электрофореза между горизонтальными пластинами. В последнем случае, прежде чем приступать к разделению, концы горизонтальной части Т, находившиеся в контакте с бумажными фитилями, следует отрезать. При pH 3,6 кислые аминокислоты (глутаминовая, аспарагиновая и цистеиновая) разделяются основные дают одно общее пятно, а нейтральные — другое. Если использовать для хроматографии систему П — Э — ФФ Хейнса и др. (см. [c.52]

Пептидную фракцию в количестве не более 0,1 мг наносят на бумагу в виде тонкой полосы длиной 2 см. Для двухмерного электрофореза Мильштейн и Сэнджер [20] применили удобную методику после разделения в первом направлении на бумажной полоске полоску пришивают на швейной машине к листу большего размера для второго разделения. Затем бумагу увлажняют буфером, используемым для разделения во втором направлении так, чтобы раствор, пропитывая бумагу с двух сторон, сконцентрировал зоны. [c.56]

Хорошим примером, показывающим, какое высокое разрешение может быть достигнуто при комбинации ИЭФ с электрофорезом в ДСН-полиакриламидном геле, служит разделение суммарной смеси белков Е. oli на 1100 фракций 1[935]. При изоэлектрофокусировании было получено 70 зон. Если же белки фракционировали только с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН, то на электрофорепрам>ме обнаруживали 100 зон. Таким образом, в результате комбинации этих методов в двухмерной системе можно было бы разделить около 7000 компонентов. Но эта величина превышает максимально возможное число белков Е. oli (4000), рассчитанное на основании средней мол. массы белков и числа кодонов в ДНК данного организма. [c.232]

Показано, что описанный метод обладает высокой воспроизводимостью и большой разрешающей способностью. Он позволяет обнаружить и количественно определить с помощью радиоавтографии белок, составляющий 10 —10 % общего количества белков в образце, что свидетельствует о его высокой чувствительности. Проведение двухмерного электрофореза не требует специального оборудова1ния. Первый этап разделения осуществляют обычно в цилиндрических гелях, для которых подходит любой прибор, предназначенный для диск-электрофореза. Точно так же на втором этапе используют любой тип приборов, пригодных для электрофореза на пластинах геля. Сконструированы также специальные приборы для двухмерного электрофореза. Кальтшмидт и Витманн, [654] описали прибор, в котором одновременно можно проводить электрофорез на 5 пластинах геля. [c.234]

Рис. 82, А. Двухмерная двойная иммунодиффузия из прямоугольных канавок. / — канавка для антигена — канавка для антител. Б. Иммуноэлектрофорез. Л 5—5 — электрофорегически разделенные компоненты смеси антигенов 2 прямоугольная канавка для смеси антигенов (стартовая зона электрофореза) б —канавка для антител (иммунной сыворотки).

Если полоски крахмального геля отбирают для иммунодиффузии путем сравнения с параллельной окрашенной полоской,, то следует учитывать, что гель сжимается в процессе окрашивания и обецвечивания. Для предотвращения ошибок на этом этапе Паулик [1030] рекомендует перед разрезанием блока геля на пластинки на его смежных сторонах вырезать через рдв-ные интервалы отверстия. При сопоставлении окрашенных и неокрашенных пластинок геля эти отверстия служат указателями для последующего вырезания участков геля, содержащих анализируемые антигены. Паулик провел иммунохимический анализ, выявив таким способом локализацию фракций, разделенных двухмерным электрофорезом в крахмальном геле [1030]. [c.244]

Впервые двухмерная система для электрофореза рибосомных белков была описана Кальтшмидтом и Уитменом [654]. Позднее сходные процедуры были применены и другими авторами. Все существующие в настоящее время методы можно разделить на две группы. К первой группе относятся методы, в которых при электрофорезе во втором направлении изменяют заряд белков, сдвигая pH буфера геля в ту или другую сторону. В методах второй группы заряд и структура белков, разделенных в первом направлении, резко изменяются в результате комплексообразования с ДСН. [c.312]

Очень важным этапом в методах двухмерного электрофореза является вымачивание гелей в буфере, применяемом для диализа, перед разделением белков во втором направлении. При длительном вымачивании, необходимом для изменения pH геля, могут происходить потери белка. Для устранения этой опасности Эвитал и Элсон [68] предложили другие способы под-кисления гелей после электрофореза в первом направлении. По предложенной ими методике разделение в первом направлении проводят так же, как в исходном методе Кальтшмидта и Уитмена [654], а затем гели либо погружают на несколько минут в охлажденную 0,3 н. НС1, либо помещают в закрытую камеру, заполненную парами хлористого водорода. Для установления необходимого времени инкубации можно использовать контрольные гели, содержащие соответствующий кислотно-щелочной индикатор. [c.313]

Во второй группе методов двухмерного электрофореза разделение рибосомных белков проводят в буферной системе, аналогичной системе Рейсфелда и др. [1072]. Далее гели помещают в раствор, содержащий ДСН, меркаптоэтанол, фосфатный буфер и 5—6 М мочевину, и инкубируют не менее 30 мин при осторожном покачивании. Затем проводят электрофорез во втором направлении на пластине геля, содержащего ДСН. Концентрация акриламида в этом геле обычно выше, чем в геле первого направления. Описано несколько вариантов метода, основанного на таком принципе [506,, 596, 827, 943]. [c.313]

Двухмерная система электрофореза была применена также для разделения транспортных РНК [1232]. Первый этап осуществляли в 15%-ном полиакриламидном геле, содержавшем МЕ5-буфер (pH 5,8) и мочевину. В этой системе транспортные РНК, выделенные из клеток Е. соН, разделялись на 15 зон. Разделение во втором натграв-лении проводили в 16%-ном полиакриламидном геле, содержавшем трис, борную кислоту и ЭДТА [984]. Результаты двухмерного электрофореза такого типа приведены на рис. 122. Следует отметить, что после электрофореза при pH 5,8 транспортные РНК можно пометить прямо в геле радиоактив ными аминокислотами, что помогает идентифицировать разделенные зоны. [c.380]

Рис, 122, Схема разделения тРНК Е. соИ методом двухмерного электрофореза в полиакриламидном геле [1232]. Стрелками указаны направления электрофореза, а рядом приведены значения pH соответствующих буферных растворов. Наиболее интенсивно окрашенные зоны на схеме обозначены точками. [c.380]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология