Плазмиды к антибиотикам

Существуют и другие, более близкие опасности. В 1974 г. Комитет по рекомбинантным молекулам ДНК Национальной Академии наук США обратился с призывом о прекращении экспериментов в двух направлениях, которые могут представить опасность для человечества в целом [269]. В своем обращении комитет подчеркнул, что использование Е. соИ для клонирования рекомбинантных молекул может оказаться опасным, поскольку эти бактерии обитают в кишечнике человека и могут обмениваться генетической информацией с бактериями, патогенными для человека. Комитет считает, что следует добровольно отказаться от исследований в двух указанных им направлениях, которые могут привести к случайному включению в хромосому генов, обусловливающих устойчивость к антибиотикам и к образованию токсинов, а также к развитию опухолей. Особые предостережения были высказаны в отношении любых планов, направленных на сцепление фрагментов ДНК животных с ДНК бактериальных плазмид или фагов. Предполагается, что контроль за проведением такого рода исследований должен осуществляться различными организациями, субсидирующими биохимические исследования [269]. [c.296]

У бактерий Г. содержатся в одной хромосоме и автономных генетич. элементах-плазмидах и эписомах, представляющих собой замкнутые кольцевые молекулы ДНК. В отличие от плазмид, эписомы могут встраиваться в хромосомы и покидать их. Размер плазмид необычайно широко варьирует. Нек-рые из них содержат 1-3 Г., тогда как размеры других составляют 10-20% от величины хромосомы и содержат сотни Г. В плазмидах расположены Г., обеспечивающие устойчивость бактерий к антибиотикам. [c.517]

Помимо ряда общих ф-ций, свойственных очень многим П (таких, как автономная репликация или ф ция переноса), существует множество спец ф-ций, детерминируемых той или иной П У бактерий наиб изучены три главные группы плазмид Р-П (факторы фертильности) ответственны за половой процесс, К-П (факторы резистентности) обеспечивают устойчивость бактериальных клеток к действию антибиотиков (напр, к стрептомицину и тетрациклину) и сульфаниламидным препаратам, в Со1-П (колициногенных факторах) локализованы гены синтеза колицинов (бактерио-цинов)-токсичных белков, к-рые не действуют на производящую их клетку, но убивают др бактерии [c.553]

Векторные плазмиды и векторные вирусы со встроенными чужеродными генами часто называют гибридными (шти химерными) плазмидами (или фагами). После конструирования рекомбинантных ДНК их с помощью трансформации вводят в реципиентный организм бактериальную, грибную, растительную или животную клетку. Трансформация предусматривает предварительную обработку клеток соединениями, обусловливающими проникновение ДНК внутрь клеток с последующим их помещением в среду, в которой способны существовать только клетки, получившие векторную молекулу, например в среду с определенным антибиотиком. [c.120]

Какова функциональная роль плазмид и мобильных элементов бактерий Ниже будет рассмотрена существенная роль этих структур в эволюции бактерий, но эволюционные, т. е. отдаленные, преимущества вряд ли могут объяснить поддержание в бактериальных клетках мобильных элементов и плазмид в тех случаях, когда они не приносят непосредственных селективных выгод. Так, например, если считать, что в клетке поддерживается только функционально необходимый генетический материал, непонятно, почему плазмиды, несущие гены устойчивости к антибиотикам, встречаются не только в клинике, где эти антибиотики применяют, но и в других местах обитания, лишенных подобного селективного давления. Совсем непонятно, почему существуют плазмиды, вообще не приносящие никаких непосредственных преимуществ содержащим их клеткам, и IS-элементы. [c.122]

Для отбора клеток, содержащих рекомбинантную ДНК, используют специальные приемы. Чтобы уменьшить количество кольцевых плазмидных молекул, образующихся ири сшивании фрагментов ДНК-лигазой Т4, рестрицированную плазмидную ДНК обрабатывают щелочной фосфатазой, удаляющей 5 -концевые фосфатные группы. Для отбора трансформированных клеток, содержащих гибридные плазмиды, проводят 1) тестирование на резистентность к определенным антибиотикам или колориметрическую реакцию 2) иммунологические тесты или выявление специфического белка - продукта клонированного гена 3) гибридизацию с зондом, комплементарным како-му-либо участку искомого гена. [c.78]

При наличии в клетке плазмиды часть энергетических ресурсов расходуется на ее репликацию, транскрипцию и синтез белков, которые она кодирует. При этом, как правило, многокопийные плазмиды требуют больше энергии, чем мал око-пийные, и в результате часть клеток в процессе роста популяции утрачивает плазмиды. Клетки, лишившиеся своих плазмид, обычно растут быстрее тех, в которых они сохранились, и в конечном счете оказываются в культуре преобладающими. По прошествии нескольких генераций это отражается на количестве синтезируемого продукта клонированного гена. Разработано по крайней мере два подхода к решению этой проблемы. В лабораторных условиях для сохранения плазмид клетки выращивают в присутствии антибиотиков или метаболитов, обеспечивающих рост только тех клеток, в которых есть плазмида. Однако добавление антибиотиков и каких-то других веществ в культуры, выращиваемые в больших объемах, или в промышленные ферментеры приводит к значительному удорожанию конечного продукта. Особенно важно, чтобы клонированные гены сохранялись, не утрачиваясь и не передаваясь другим микроорганизмам, в том случае, когда сконструированный микроорганизм предназначен для использования вне стен лаборатории. Он должен не только оставаться эффективным, но и быть экологически безопасным. Включение клонированной ДНК в хромосомную ДНК хозяйского организма позволяет обойтись без плазмид и избежать утраты плазмидных генов. [c.123]

Рестрикция ферментом, расщепляющим плазмиду на участке одного из генов устойчивости к антибиотику [c.103]

Кроме хромосомы у большинства видов бактерий существуют другие способные к автономной репликации структуры — плазмиды. Это дву цепочечные кольцевые ДНК размером от 5 до 0,1 % размера хромосомы, несущие гены, не обязательные для клетки-хозяина, или гены, необходимые лишь в определенной среде. Например,, плазмиды (R-факторы) многих клинических шта.м.мов несут устойчивость к антибиотикам, как правило, сразу к нескольким. Другие плазмиды определяют болезнетворность патогенных бактерий, например патогенных штаммов Е. oli, возбудителей чумы и статб-няка. Третьи — определяют способность почвенных бактерий ис пользовать необычные источники углерода, скажем нафталин. [c.110]

Транспозонами (Тп-элементами) называют сегменты ДНК, обладающие теми же свойствами, что и IS-эле.менты, но содержащие кроме того, гены, не и.меющие непосредственного отношения к транспозиции. Транспозоны могут нести гены устойчивости к антибиотикам, гены токсинов или гены дополнительных фер.ментов клеточного метаболизма. В общем, для транспозонов характерны те же гены, которые встречают в плазмидах. Более того, нередко присутствие в составе плазмиды того или иного гена обусловлено наличием в последовательности плазмидной ДНК соответствующего транспо-зона (см. раздел 3 этой главы). Транспозон может быть устроен так же, как IS-элемент, но с дополнительным геном. Однако важно отметить, что часто два IS-элемента, оказавшиеся поблизости друг от друга, способны перемещаться вместе, одновременно перенося заключенный между ними сегмент ДНК- Таким образом, два расположенных рядом lS-эле.мента могут образовать транспозон. Транс- [c.113]

Среди П, обеспечивающих устойчивость бактерий к антибиотикам, осн массу составляют т наз факторы множеств резистентности, несущие сразу неск соответствующих детерминант С помощью трансмиссибетьных П детерминанты резистентности легко могут распространяться между видами, способными к конъюгации На такие П гены резистентности могут передаваться с помощью транспозонов Кроме детерминант лек резистентности из числа функцион элементов П хорошо изучены гены нек-рых бактериальных токсинов, напр энтеротоксинов, вырабатываемых возбудителями кишечных инфекций, носителями т наз Тох-П (факторов патогенности энтеробактерий) Показана способность Тох-П передаваться между бактериями в организме животных и человека На этих П могут находиться также детерминанты резистентности к антибиотикам В этой связи активно развивается новое направление в практич бактериологии-поиск и создание в-в, избирательно подавляющих репликацию плазмид или экспрессию их генов Пример таких в-в-клавулановая к-та (ф-ла I) и ее производные - ингибиторы Р-лактамазы [c.553]

Отбор бактерий-трансформантов можно продемонстрировать, используя плазмиду pBR322 (см. рис. 5.10), содержащую два гена устойчивости к тетрациклину и ампициллину. Для отбора этих бактерий в агар добавляют антибиотик — или ампициллин, или тетрациклин в зависимости от того, какой из генов (Ыа или tet) остался интактным после введения чужеродной ДНК. На такой среде клоны образуют клетки только с плазмидами. Для отделения рекомбинантных бактерий часть материала каждого клона переносят на другую чашку Петри, содержащую антибиотик, ген устойчивости к которому был разрушен при создании рекомбинантов. На этих чашках Петри дают клоны только те бактерии, которые содержат исходную плазмиду, а рекомбинантные бактерии их не образуют. Такая тщательная селекция клонов по устойчивости к антибиотику позволяет идентифицировать рекомбинантные клоны. При поиске рекомбинантных клонов успешно применяют метод авторадиографии. [c.121]

На втором этапе проводят разделение этих двух вариантов. Клетки, выросшие на среде с ампициллином, переносят на среду с тетрациклином методом перепечатки. Клетки, образующие колонии на чашках с тетрациклином, содержат интактную плазмиду рВК322, поскольку, как мы уже говорили, они устойчивы и к ампициллину, и к тетрациклину. Клетки, не выросшие на чашках с тетрациклином, чувствительны к этому антибиотику, значит, они содержат гибридную плазмиду рВК322. [c.60]

Оказавшись в бактериальной клетке, линейная молекула pLFR-5 со вставкой замыкается в кольцо благодаря спариванию os-сайтов. В такой стабильной конфигурации она может долгое время существовать в клетке и реплицироваться как гибридная плазмида, поскольку содержит все необходимые для этого элементы. Более того, ген устойчивости к тетрациклину обеспечивает рост колоний, несущих данную космиду, на среде с этим антибиотиком нетрансформированные клетки при этом погибают. Существуют и другие космидные векторы на основе фага X. [c.76]

К счастью, правильно спланировав эксперимент, можно минимизировать влияние метаболической перегрузки, оптимизировать выход рекомбинантного белка и повысить стабильность трансформированных хозяйских клеток. Например, нагрузку можно снизить, если использовать малокопийные плазмидные векторы. А еще лучше вообще отказаться от векторов и встроить чужеродную ДНК в хромосомную ДНК организма-хозяина. В этом случае не нужно заботиться об обеспечении стабильности плазмиды. Кроме того, клетке не приходится расходовать свои ресурсы на синтез ненужных продуктов, кодируемых маркерными генами устойчивости к антибиотикам. Синтез продуктов таких генов, входящих в состав плазмидных векторов наряду с генами-мишенями, является одной из основных причин метаболической перегрузки. Интеграция в хромосому особенно важна в тех случаях, когда используется сам рекомбинантный микроорганизм, а не синтезируемый им продукт. Уменьшению метаболической перегрузки помогает также применение сильных, но регулируемых промоторов. В таких случаях ферментацию проводят в две стадии. На первой из них, во время роста, промотор, контролирующий транскрипцию гена-мишени, выключен, а на второй, во время индукции, -включен. [c.128]

Однако этот микроорганизм растет относительно медленно и использует лишь ограниченное число источников углерода, что делает производство довольно дорогим. Можно использовать другой путь при перенесении генов биосинтеза этого полимера в Е. соИ получаются быстрорастущие трансформанты, накапливающие в большом количестве (до 95% сухой массы клетки) поли(3-гидроксимасляную кислоту). Поли(3-гид-роксимасляная кислота) синтезируется из ацетил-СоА в три стадии, катализируемые тремя разными ферментами (рис. 12.22). Оперон, содержащий эти гены, был встроен в плазмиду в составе фрагмента длиной 5,2 т.п.н., однако в отсутствие селективного давления, например при росте в отсутствие антибиотиков, примерно половина клеток Е. соИ теряла данную плазмиду уже после 50 генераций. Это не очень существенно, когда масштабы культивирования малы, но становит- [c.270]

Культуру в объеме 5 л выращивали при 30 °С в присутствии ампициллина и канамицина, с тем чтобы обеспечить условия для сохранения обеих плазмид, а затем использовали в качестве посевного материала для инициации роста культуры без антибиотиков при 30 °С в реакторе с рабочим объемом 45 л. Суспензия клеток из 45-ли-трового ферментера в свою очередь служила посевным материалом для культивирования в биореакторе на 600 л, в котором клетки продолжали выращивать при 30 °С без антибиотиков (рис. 16.6). (Вообще говоря, для уменьшения стоимости процесса антибиотики при крупно- [c.362]

Вначале чужеродные гены вводили в ДНК хлоропластов в составе плазмидного вектора, несущего неселективную чужеродную ДНК и селективный маркер, например ген устойчивости к антибиотику, фланкированные специфическими последовательностями хлоропластной ДНК (рис. 17.7). Такая стратегия была весьма эффективной, однако нередко селективный маркер мешал экспрессии фланкирующих хлоропластных генов. Чтобы решить эту проблему, разработали стратегию, в которой селективный маркер и чужеродный ген не были физически связаны друг с другом. Для этого растения табака трансформировали смесью одинаковых количеств двух разных плазмид одна содержала селективный маркер (ген устойчивости к спектиномицину), фланкированный ДНК из одного участка хлоропластной ДНК, а вторая — чужеродный ген (ген устойчивости к канамицину), фланкированный последовательностями из другого участка [c.385]

Таким путем получают множество фрагментов исходной ДНК, встроенных в ДНК вектора (клонотеку). Далее рекомбинантными ДНК трансформируют клетки бактерии-хозяина (специальные штаммы E. oli, не содержащие других плазмид или фаговых ДНК). В разные клетки могут попадать разные фрагменты ДНК донора (или вообще не попадать). Поэтому клетки рассевают таким образом, чтобы потомство каждой из них (клон) получить отдельно. При использовании плазмид в качестве векторов отбирают только клоны, выживающие в присутствии антибиотика, ген устойчивости к которому не содержит сайта рестрикции использованной рес-триктазы. Это тест на присутствие плазмиды в клетке хозяина. [c.104]

В более примитивных прокариотических клетках ДНК не выделяется специальной дополнительной мембраной. Обычно эти клетки содержат одну гигантскую молекулу двуспиральной ДНК, состоящую из нескольких миллионов нуклеотидов. Иногда, по аналогии с эукариотической клеткой, ее называют хромосомной ДНК. В некоторых случаях в прокариотических клетках, в дополнение к этой ДНК, присутствуют еще и относительно маленькие молекулы ДНК (длиной в несколько тысяч- нуклеотидов), несущие дополнительную информацию их называют плазмидами. В большинстве случаев плазмиды копируются независимо от хромосомной ДНК и клетки могут содержать ряд подобных молекул. Несмотря на маленькие размеры, они придают клетке ряд особенностей, чрезвычайно важных для их выживания, например устойчивость к определенным антибиотикам. Прокариотические клетки обладают относительно маленькими размерами. Их линейные размеры имеют порядок 1 мкм, а самые маленькие из известных прокариотических клеток — микоплазмы — имеют размер около 0,3 мкм. Все прокариотические клетки могут функционировать независимо и, следовательно, должны рассматриваться как одноклеточные живые организмы (прокариоты). К этой группе живых организмов относят микоплазмы, бактерии и синезеленые водоросли (цианобактерии). Бактерии можно разделить на две основные группы эубактерии (действительные бактерии) и. архебактерии. К последним относят микроорганизмы, живущие в экстремальных условиях — в горячей или сильнокислотной среде (термоатщдофилы), в концентрированных соляных растворах (галофилы) и др. Условия жизни архебактерий, по-видимому, достаточно близки к тем,"которые существовали на Земле в период зарождения жизни. [c.23]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология