Деградация белков с помощью ФТЦ

Фаговые гены, участвующие в синтезе ДНК в инфицированной клетке, можно идентифицировать с помощью мутаций, которые предотвращают или задерживают образование зрелых фаговых частиц. Наиболее важные из них (существенные гены) идентифицированы при изучении условно-летальных мутантов, которые можно отнести к трем фенотипическим классам. Если в результате мутации синтез ДНК полностью подавлен, можно сделать вывод, что белок, кодируемый мутантным геном, либо представляет собой необходимый компонент репликационного аппарата, либо участвует в обеспечении синтеза ДНК предшественниками (особенно гидроксиметил-цитозином). Мутации, вызывающие задержку синтеза ДНК, по-видимому, затрагивают гены, связанные с инициацией репликации ДНК. Фаги, у которых синтез инициируется, а затем останавливается, вероятно, несут мутации, затрагивающие регуляторные функции, ДНК-лига-зу и некоторые ферменты, связанные с деградацией ДНК клетки-хозяина. Имеются также несущественные гены. [c.427]

Существует несколько методов, с помощью которых можно обнаружить аминокислотные остатки, ответственные за биологическую активность белков. В первом методе белок необходимо подвергнуть частичной деградации, в особенности вблизи Л/- и С-кон-цов соответственно с помощью аминопептидаз и карбоксипептидаз. Например, удаление (с помощью карбоксипептидазы) трех остатков с С-конца рибонуклеазы не влияет на ее активность. Более глубокая деградация в этой части молекулы, однако, приводит к инактивации. По второму методу необходимо подвергнуть химической модификации боковые группы аминокислотных остатков белка. Естественно, что результаты такого рода экспериментов проще интерпретировать в том случае, когда эта модификация специфична. Например, легко идентифицировать область связывания кофермента пиридоксальфосфата в аминотрансферазе. Альд-имин, образующийся в результате конденсации кофермента с е-аминогруппой остатка лизина, восстанавливают борогидридом натрия и идентифицируют, так как он не затрагивается при гидролитическом распаде. Аналогично, ферменты, содержащие тиольные группы, такие как алкогольдегидрогеназа, 3-фосфоглицераль-дегиддегидрогеназа и папаин, обычно ингибируют реакцией с п-хлормеркурибензойной или иодуксусной кислотой. Специфичность модификации белков можно усилить, если структура реаген- [c.282]

Еще одна проблема - невысокая стабильность белков, кодируемых клонированными генами. Рекомбинантный белок может расщепляться про-теиназами хозяйской клетки. Чтобы избежать этого, можно изменить клонированный ген таким образом, чтобы на N-конце белковой молекулы оказались одна или несколько дополнительных аминокислот. В такой форме рекомбинантный белок уже не подвергается столь быстрой деградации. Кроме того, лишние аминокислоты иногда помогают в последующей очистке химерного белка, например с помощью иммуноаффинной хроматографии на колонке. При этом место соединения компонент подбирается так, чтобы по нему можно было расщепить молекулу (химическим или ферментативным путем) и получить эти компоненты в чистом виде. [c.130]

Уменьшение количеств белков и пептидов, необходимых для анализа их структуры, является одной из центральных проблем, стоящих перед исследователями. С целью ее решения ведется поиск новых методов изучения структуры, в частности более чувствительных способов идентификации производных аминокислот (см. с. 61). Один из перспективных подходов заключается в широком использовании радиоактивных методов анализа. В ряде лабораторий при деградации пептидов в секвенаторе применяется радиоактивный или С-ФИТ1Д. Можно вводить радиоактивную метку непосредственно в анализируемый белок. Для многих белков это достигается добавлением радиоактивно меченных аминокислот непосредственно в питательную среду, на которой выращивается культура, являющаяся источником исследуемого белка. Таким же путем оказывается возможным радиоактивно метить белок избирательно по определенным аминокислотным остаткам. Если белок, радиоактивно меченный, например, по остаткам лейцина, анализировать с помощью секвенатора, то простое измерение радиоактивности экстрактов, содержащих анилинотиазолиноны, позволяет безошибочно определить, в каких положениях полипептидной цепи в N-концевой области белка расположены остатки лейцина (рис. 31). Аналогичным образом можно определить положение и других аминокислотных остатков. Такой прием используется для анализа N-koh-цевой последовательности предшественников белков, доступных лишь в ничтожно малых количествах. Для исследования полной структуры он, однако, не применяется из-за дороговизны и трудоемкости. [c.79]

Идентификация аминокислот, присутствующих в активных центрах ферментов, разумеется, очень важна для понимания главных особенностей механизма ферментативных реакций. Существует ряд методов, с помощью которых можно идентифицировать хотя бы некоторые из аминокислотных остатков, участвующих в построении активного центра. Наиболее прямой метод состоит в присоединении к какому-нибудь аминокислотному остатку, входящему в состав активного центра, ковалентной метки, которая оставалась бы устойчивой в условиях деградации полипептидных цепей. С точки зрения такой возможности все ферменты можно разделить на два класса в один из них входят ферменты, образующие в ходе каталитического процесса ковалентно связанные промегкуточные фермент-субстратные производные, а в другой — ферменты, которые таких производных не образуют. Для ферментов первого класса проблема введения специфической метки в активный центр (а не просто неспецифического введения метки в белок) часто решается путем использования в качестве носителей метки либо обычных субстратов этих ферментов, либо соединений, структурно родственных субстрату. Вследствие специфического сродства этих веществ к активному [c.196]

Определенную роль в процессе деградации ДНП, по данным Хагена [37], может играть радиационное ослабление связи ДНК— белок, вероятно, обусловленное уменьшением количества ионов кальция в этом комплексе. Хаген считает, что после общего рентгеновского облучения крыс дозами 500 и 1000 р уже через час ослабление связи ДНК — белок проявляется в значительном увеличении количества ДНК, экстрагируемой из ядер тимуса при помощи трихлорацетофенольного метода. [c.94]

Методы выделения и идентификации мономеров дают информацию о молекулярной массе олигомера и его субъединиц, их количестве и свойствах, позволяют получать препараты для определения первичной структуры. Если удается получить белок в виде кристаллов, изучение первичной структуры удобно вести параллельно с помощью секвенирования и физических методов (например, рентгеноструктурного анализа), поскольку сопоставление получаемой информации существенно ускоряет ход анализа [158]. Однако такая возможность представляется редко. Часто именно получение достаточно чистых препаратов белка или субъединиц, пригодных для проведения аминокислотного анализа, и составляет одну из главных проблем, поскольку исследуемый белок может присутствовать лишь в незначительных количествах в сложной смеси сопутствующих белков и продуктов их деградации или же исходная смесь может содержать белки с очень близкими свойствами. Если белок плохо растворим и требует более жестких условий для солюбилизации, гетерогенные препараты могут быть получены уже на начальном этапе выделения. Причиной появления гетерогенности можег быть, по-видимому, изменение суммарного заряда из-за дезамидирования амидных групп аспарагина и глутамина, карбами-лирование е-аминогрупп некоторых остатков лизина ионом цианата, присутствующим в растворах мочевины [38], неспецифическая модификация остатков метионина и гистидина при алкилировании цистеина. [c.16]

Проблема внутриклеточной стабильности рекомбинантных белков больше связана с деградацией небольших пептидов, поскольку крупные нативные белки более стабильны в бактериальных клетках. Один из подходов, позволяющих стабилизировать короткие чужеродные пептиды в клетках Е. соН, - включение требуемого пептида в состав гибридного белка. В этом случае последовательность нуклеотидов, кодирующую гибридный белок, соединяют в составе экспрессирующего вектора в одной рамке считывания с бактериальным геном, кодирующим белок (например, геном -галактозидазы). Образующийся в результате экспрессии такого рекомбинантного гена гибридный белок в своем составе содержит в N- или С-концевой части требуемый пептид, защищенный основным белком-носителем от протеолитической деградации. Для отделения пептида от белка-носителя их соединяют друг с другом последовательностью аминокислот, по которой можно провести специфическое расщепление полипептидной цепи. В том случае, если пептиды не содержат метионина, соединение белка-носителя и пептида осуществляют через эту аминокислоту, и отщепление пептида производят с помощью бромистого циана. Такой подход был использован, например для получения рекомбинантного соматостатина, а также А- и В-цепей инсулина. [c.117]

Лауфер показал, что диссоциация полимеризованного белка ВТМ в 0,2 М мочевине нри pH 6,5 и температуре около 2 °С происходит боло интенсивно, чем в отсутствие мочевины [1045. Под действием 1,8 ikf мочевины при pH 6,6 и температуре 23 °С происходит очень быстрая деполимеризация с последующей медленной и необратимой денатурацией белка. Базел [309, 310] провела детальные исследования процесса деградации ВТМ в присутствии 6 М мочевины при О °С и показала, что при этом образуются два основных типа палочкообразных частиц — длиной около 160 им и 60—80 нм. С помощью седиментациоиного анализа и электронной микроскопии было установлено, что более длинные палочки имели хвосты РНК, выступающие с одного конца. Это в свою очередь позволило предположить, что под действием мочевины белок отщепляется с одного конца вирусиой частицы. Небольшая часть палочкообразных частиц ВТМ в этих препаратах обладала значительно большей устойчивостью к мочевине, чем основная их масса. [c.338]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология