ФТГ-производные аминокислот идентификация

Количественный анализ аминокислот методом ГХ представляет несомненный интерес. Как правило, количественное определение аминокислотного состава пептида является одним из решающих моментов анализа последовательности. Поскольку при деградации крупного белка образуется большое число фрагментов, желательно затрачивать на анализ каждого из них минимальное количество времени и вещества. Привлечение в данном случае ГХ достаточно хорошо удовлетворяет этим условиям. Многочисленные исследования по ГХ аминокислот в конечном итоге направлены на решение этой задачи. Однако к действительно эффективному количественному методу предъявляются несоизмеримо более высокие требования, чем к качественному. Если учесть к тому же трудности получения и разделения производных аминокислот, станет ясно, почему до сих пор не разработан стандартный метод их количественного определения с помощью газового хроматографа. Основные трудности связаны, как подчеркивалось в разделе о получении производных, с полифункциональными аминокислотами. Метод, игнорирующий их идентификацию, может найти лишь ограниченное применение. Количественный анализ только простых аминокислот не может удовлетворять экспериментатора [40]. Вопрос о том, все ли аминокислоты, встречающиеся в белках, можно определять ГХ с достаточной точностью, все еще остается открытым. Здссь можно только вкратце рассмотреть имеющиеся условия и возможности. Проблемы, связанные с аппаратурой, необходимой для количественной ГХ, уже обсуждались ранее (см. стр. 302). [c.335]

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ФТГ-ПРОИЗВОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ [c.196]

Основное достоинство качественного ГХ-анализа аминокислот состоит в быстром разделений и достоверной идентификации компонентов неизвестной смеси. Однако окончательно идентифицировать органические соединения на одной колонке нельзя — ни по известным относительным удерживаемым объемам, ни по известным стандартным соединениям. Поэтому компоненты необходимо хроматографировать на нескольких колонках различной полярности. Правда, подобрать несколько таких колонок, имеющих удовлетворительную разрешающую способность, довольно трудно. Если задача сводится к обнаружению природных аминокислот, то их можно определить и на одной колонке, но все-таки гораздо лучше фракционировать производные аминокислот на нескольких колонках и характеризовать их величинами относительных удерживаемых объемов. Например, присутствие неизвестной или необычной аминокис- [c.331]

Идентификация растворимых в воде и кислотах ДИФ производных аминокислот была проведена [181] в системе н.пропанол — 34 о-ный аммиак (7 3) при этом получены следующие значения Я/ для моио-ДИФ (цис)-2 — 0,29 ДНФ-цис-ЗОзН - 0,29 а-ДНФ-арг - 0,43 е-ДНФ-лиз — 0,44 о-ДПФ-тир — 0,49 а-ДИФ-гис — 0,57 ди-ДНФ-гис — 0,654 [c.94]

Хроматография производных аминокислот получила интенсивное развитие в связи с разработкой методов определения первичной структуры белков. Вероятно, трудно найти в органической химии и биохимии более удачный пример столь тесной взаимосвязи развития представлений о структуре и функциях большого класса веществ, каким являются белки, с хроматографическими методами анализа. Основное внимание было направлено на разработку методов определения N-концевых остатков аминокислот в белках, причем в идентификации соответствующих производных большое значение имели тонкослойная (ТСХ) и бумажная хроматография (БХ) (см. обзоры [1, 2]). Газожидкостная и жидкостная колоночная хроматографии находят в этой области ограниченное применение, однако интерес к последнему методу постепенно растет. Интерес к жидкостной хроматографий вызван вполне определенными причинами. Во-первых, постоянно появляются новые методы избирательной модификации остатков аминокислот в белках, а идентификация производных аминокислот требует развития хроматографических методов. Во-вторых, исследованию подвергают все более труднодоступные белки, что в свою очередь вызывает необходимость создания надежных методов количественного анализа. Интерес к колоночной хроматографии возрастает также в связи с выделением и получением необычных аминокислот, а также в связи с необходимостью предотвращения ошибок при определении аминокислотной последовательности. Понятия современный и классический метод используют здесь условно, поскольку новые методики обычно создают на базе стандартной аппаратуры примером может служить автоматический анализ ДНФ- и ДНС-аминокис-лот [3, 4]. Насколько известно, до сих пор не пытались использовать скоростную хроматографию высокого разрешения для разделения производных аминокислот, хотя некоторые соединения, например ДНС-аминокислоты, являются для этого метода довольно удобным объектом. Производные аминокислот использовали в структурном анализе белков крайне неравномерно. По-видимому, всеобщее увлечение ДНФ-аминокислотами проходит окончательно, уступая место повышенному интересу [c.360]

Многие обобщения, касающиеся Н-гидроксиаминокислот, существовавшие в ранней литературе, противоречивы и неточны. Это было выяснено в 1961 г., когда появилось сообщение о том, что полученные в то время соединения обычно бывали загрязнены -аминокислотами и другими побочными продуктами синтеза. Кислоты (28)—бесцветные кристаллические соединения с высокими температурами плавления они не растворимы в большинстве органических растворителей, но растворимы в воде, амфотерны и имеют изоэлектрическую точку в области pH 4 [91]. При нагревании водных растворов этих соединений они медленно разлагаются, диспропорционируя до аминокислоты и оксиминокислоты (которые сами по себе неустойчивы при pH ниже 7) схема (30) [91]. Ацилирующие агенты дают смеси продуктов за счет атаки по кислороду и азоту (преобладает -ацилирование) [92]. Простейшим методом получения производных для идентификации является каталитическое восстановление [93] до а-аминокислот, которое протекает гладко. Н-Гидроксиаминокислоты можно окислять (например, при диспропорционировании по схеме (30) они восстанавливают Фелингову жидкость [89]. Известны также изомерные а-аминооксикислоты [94]. [c.249]

Идентификация ДНФ-производных аминокислот, растворимых в кислоте и воде, на силикагеле со смесью -пропанол—34 % -ный гидроксид аммония (7 3) [107] [c.496]

Динитрофенильные (ДНФ) производные аминокислот имеют большое значение, поскольку они легко хроматографируются и для открытия пятен не требуется индикатора. Приготовление этих производных применяют для идентификации и определения свободных аминогрупп в белках и полипептидах [188]. Для хроматографических целей нет необходимости выделять производные в чистом виде. Следует отметить, что другие группы (кроме [c.440]

Сравнительная подвижность и значение / / производных аминокислот при ТСХ в некоторых системах растворителей приведены в табл. 7. Эти значения получены при нанесении примерно 1 мкл раствора аминокислотного производного (от 10 до 50 мг на 1 мл хлористого метилена или этилацетата). Чистоту БОК-аминокислот определяют путем опрыскивания хроматограмм нингидрином до и после удаления защитной БОК-группы под действием паров соляной кислоты (см. стр. 143). Для идентификации некоторых других групп в ряде производных можно также применять реактив с иодидом калия и другие проявляющие реактивы ( см. стр. 142—146). Примерные значения Rf для некоторых производных аминокислот в различных системах растворителей приведены в табл. 8. Правильные результаты получаются при условии нанесения на хроматограмму небольших количеств производных при нанесении же на хроматограмму большого количества вещества значение -/ / искажается, но зато более четко выявляются примеси. [c.139]

Отщепление по Эдману при помощи ФИТЦ — наиболее распространенный и надежный метод определения аминокислотной последовательности пептидов и белков, В настоящее время в анализе и больших, и малых пептидов используют ручной и автоматический методы при этом в большинстве случаев идентификацию отщепленных аминокислот проводят в виде их ФТГ-производных. Анализу последних посвящено множество статей, В этой главе рассматривается пять основных методов анализа ФТГ-производных аминокислот. [c.405]

Метод позволяет определять последовательность аминокислот, расходуя менее 10 нмоль образца. Для уверенной работы на уровне <1 нмоль необходимо коренное усовершенствование методологии, в том числе разработка высокочувствительной идентификации отщепляемых производных аминокислот. В этом отношении, в частности, очень велики возможности масс-спектрометрии. Следует отметить, что при повышении чув- [c.438]

Все это является прямым доказательством существования кова т лентной связи между активным красителем и белковым волокном. Выделение и идентификацию дихлортриазиновых производных аминокислот из окрашенных активными красителями коллагено-вых волокон пока осуществить не удалось, так как ковалентная связь такого красителя с белком не более устойчива к гидролизу, чем пептидная или аминокислотная, и поэтому она разрушается при гидролизе. [c.319]

Тонкослойная хроматография на силикагеле оказалась весьма полезной для идентификации фенйлтиогидантоиновых производных аминокислот (ФТГ-аминокислот). Для предварительного определения этих соединений Бреннер и др. [4] рекомендовали двумерное разделение сначала в смеси хлороформ—метанол (9 1) и затем в смеси хлороформ — муравьиная кислота (100 5). Чтобы идентифицировать ФТГ-аминокислоты, на той же хроматографической пластинке фракционируют стандартные растворы известных аминокислот. [c.236]

Расщепление полипептидной цепи на фрагменты проводят обычно при помощи протеолитических ферментов, таких, как трипсин, химотрипсин или пепсин. Эти ферменты действуют на различные участки полипептидной цепи, так как имеют повышенное сродство к различным аминокислотным остаткам. Необходимо учитывать также соседние аминокислотные остатки, т. е. пространственное окружение атакуемой пептидной связи. Оказалось, что трипсин гидролизует только те пептидные связи, в образовании которых участвует карбоксильная группа лизина или аргинина, а химотрипсин гидролизует связи по фенилаланину, триптофану и тирозину Обычно протеолитические ферменты, гидролизующие полипептидные цепи, предварительно иммобилизуют на нерастворимых матрицах для более легкого отделения их от продуктов гидролиза. Далее определяют аминокислотные последовательности каждого полипептидного фрагмента. Для этого чаще всего используют метод Эдмана, заключающийся в анализе полипептида только с Ж-конца. Концевая аминокислота при взаимодействии с фенилизотиоцианатом в щелочной среде образует стойкое соединение, которое можно отщепить от полипептида без его деградации. Фенилтиогидантоиновое (ФТГ) производное аминокислоты идентифицируется хроматографическим методом. После идентификации концевого Ж-амино-кислотного остатка метка вводится в следующий аминокислотный остаток, [c.41]

Уменьшение количеств белков и пептидов, необходимых для анализа их структуры, является одной из центральных проблем, стоящих перед исследователями. С целью ее решения ведется поиск новых методов изучения структуры, в частности более чувствительных способов идентификации производных аминокислот (см. с. 61). Один из перспективных подходов заключается в широком использовании радиоактивных методов анализа. В ряде лабораторий при деградации пептидов в секвенаторе применяется радиоактивный или С-ФИТ1Д. Можно вводить радиоактивную метку непосредственно в анализируемый белок. Для многих белков это достигается добавлением радиоактивно меченных аминокислот непосредственно в питательную среду, на которой выращивается культура, являющаяся источником исследуемого белка. Таким же путем оказывается возможным радиоактивно метить белок избирательно по определенным аминокислотным остаткам. Если белок, радиоактивно меченный, например, по остаткам лейцина, анализировать с помощью секвенатора, то простое измерение радиоактивности экстрактов, содержащих анилинотиазолиноны, позволяет безошибочно определить, в каких положениях полипептидной цепи в N-концевой области белка расположены остатки лейцина (рис. 31). Аналогичным образом можно определить положение и других аминокислотных остатков. Такой прием используется для анализа N-koh-цевой последовательности предшественников белков, доступных лишь в ничтожно малых количествах. Для исследования полной структуры он, однако, не применяется из-за дороговизны и трудоемкости. [c.79]

Абдергальден и Стикс [131] впервые получили динитрофенильные производные аминокислот при кипячении щелочных растворов аминокислот с 1-хлор-2, 4-динитробензолом. Соответствующее фторпроизводное, рекомендованное Сангером [132, 133], реагирует с аминокислотами в растворе бикарбоната при комнатной температуре и потому практически более удобно. Все N-динитрофенильные производные аминокислот скрашены в желтый цвет, что облегчает их идентификацию на хроматограммах. Некоторые аминокислоты реагируют более чем с одним молем реагента так, в реакцию с 1-фтор-2,4-динитробензолом вступают как а-, так и со-аминогрупны лизина и орнитина, имино-азот гистидина, фенольная группа тирозина и сульфгидрильная группа цистеина. Поэтому перечисленные аминокислоты образуют бис-динитрофенильные производные. [c.35]

Карбобензоксиаминокислоты и их эфиры применяются в пептидном синтезе, и требования к их чистоте очень высокие. Идентификацию и проверку чистоты этих производных аминокислот удобно проводить на тонких слоях полиамида. Ванг [712] изучил хроматографическое поведение 18 М-карбобензоксиамино-кислот и их эфирных производных на полиамидных слоях, нанесенных на полиэфирную пленку (табл. 36). [c.102]

Особенно широко применяют при идентификации летучих производных аминокислот метод ГЖХ в сочетании с такими инструментальными методами, как ИК-спектроскопия, масс-снектромет-рия, а также другие варианты хроматографии, в частности ионообменную, хроматографию на бумаге и в тонком слое. [c.69]

Аминокислоты изучены в таблетках из бромистого калия [75, 81] и в водных растворах с различными pH 38]. Спектры диннт-рофеннлового [45] и тиогндантоинового [107] производных аминокислот оказались полезными при идентификации концевых азотсодержащих групп в пептидах и белках. Характеристические данные, касающиеся полимеров, также получены из исследований ИК-спектров [1, 14—16, 82]. При исследованиях подобного рода было показано, что рибонуклеиновая и дезоксирибонуклеиновая кислоты обладают характеристическими ИК-спект-рамн. [c.114]

Эти производные аминокислот образуются при разложении продуктов реакции белков или пептидов с фенплизотиоцианатом. Они очень удобны при изучении структур пептидов и позволяют отделить аминокислоты от мешающих анализу соединений. Кроме этого, с появлением усовершенствованного автоматического способа разделения аминокислот стал необходим метод идентификации этих соединений, поскольку за 72—90. мин с одним производным можно провести от 10 до 25 операций. В качестве такого быстрого метода идентификации соединений была предложена газовая хроматография однако в ряде случаев результаты анализа недостаточно однозначны и требуют подтверждения. [c.501]

Для проявления и идентификации аминокислот, производных аминокислот и пептидов хроматограммы опрыскивают специальными реактивами. Опрыскивание реактивом Сакагучи нельзя применять при ТСХ на пластинках с силикагелем, остальные реактивы можно использовать как в случае бумажной, так и тонкослойной хроматографии. (Подробнее о реактивах для опрыскивания см. работы [96, 123, 126, 146].) Опрыскивание некоторыми реактивами можно проводить последовательно и, таким образом, получать максимальную информацию из одного опыта (см. работу [24]). Величины проявляемых пятен должны соответствовать обшепринятым для хроматографии и электрофореза. Если применять слишком много проявляющего реактива, особенно в тех случаях, когда нанесенные вещества в нем растворимы, то пятна на хроматограммах и фореграммах будут получаться расплывчатыми. При опрыскивании хроматограмм, содержащих аминокислоты и пептиды, водными растворами последние следует тщательно распылять и наносить в весьма умеренных количествах. Использование того или иного проявляющего реактива с погружением в него допустимо лишь в том случае, если [c.142]

Имеются доказательства, что в реакциях производных карбоновых кислот образуются ковалентные промежуточные соединения фермент — субстрат. Большинство из них очень неустойчиво и распадается в ус> ловиях, требуемых для идентификации производных аминокислот. Поэтому большое значение имело открытие, что нервный газ — диизопропилфторфосфат (ДИФФ)—реагирует стехиометрически с эстеразами, давая устойчивый ковалентный фосфорилированный фер [c.131]

Восстановление [ С]цианидом натрия в аммиаке [130]. Этот метод специально разработан для идентификации поперечных связей в фибриллярных белках, поскольку в случае фибрина реакция ]юсстаиовления борогидр1 дом натрия (при pH 8) идет с низким выходом и плохо воспроизводима. Продукт реакции — аминонитрил или производное аминокислоты, отражающее строе- [c.70]

I2.6A.L Отщепление по Эдману с применением меченого реагента, В литературе описано несколько методик, использование которых может существенно снизить расход образца, В одной из таких методик применяется радиоактивно меченный ФИТЦ [6, 8, 9, 27]. Следует работать только с чистым реагентом, так как примеси, присутствующие в исходном ФИТЦ, а также образующиеся в ходе отщепления, делают идентификацию ФТГ-производных аминокислот ненадежной. Уровень радиоактивного фона зависит также от того, насколько плотно подтянуты уплотнения клапанов и резьбовые соединения. Гораздо чище проходит анализ структуры пептидов и белков, меченных in vivo. Трудности, связанные с использованием метки в белках или реагентах, обсуждаются в работе [44]. [c.402]

Метод тонкослойной хроматографии (ТСХ), использованный Эдманом и Бэггом и описанный в их классической работе, посвященной автоматическому секвенатору [2], наиболее прост в экспериментальном отношении, не требует дорогого оборудования, но характеризуется невысокой чувствительностью (- 1 нмоль), тех удобна как для ручного, так и для автоматического определения последовательности однако это скорее качественный, чем количественный метод. Как бесспорное достоинство метода надо отметить возможность одновременного анализа нескольких образцов. Метод можно сделать полуколичественным, элюируя ФТГ с хроматографической пластинки, но обычно это не делается. При идентификации ФТГ-Arg и ФТГ-Н з ТСХ следует дополнять другими методами — ВЭЖХ тех же ФТГ-аминокислот, или аминокислотным анализом свободных аминокислот, полученных при обратном гидролизе ФТГ-аминокислот. Следует проводить обратный гидролиз при анализе только коротких пептидов и высокоэффективном определении последовательности аминокислот средних пептидов на секвенаторе с использованием наномольных количеств образца. Для анализа ФТГ-производных аминокислот с середины 60-х годов стала использоваться газожидкостная хроматография (ГЖХ). Этим методом можно быстро и количественно определить большинство, но не все с "ГГ-производные аминокислот. В неспособности ГЖХ обеспечить однозначную идентификацию ФТГ-производных всех 20 аминокислот заклю- [c.405]

I3.2.L6. Анализ ФТГ-производных аминокислот в продуктах отщепления t 0 Эдману. При аиализе более чем I нмоль исходного пептида идентификация ФТГ-произвоД 1ых обычных аминокислот, полученных в ходе ручного или автоматического определения последовательности по Эдману, являек я однозначной. При работе с количествами >1 нмоль образца примеси, вносимые из секвенаторных реактивов, обычно не влияют на ВЭЖХ. [c.415]

Разделение производных Пе и Leu достигается одномерной хроматографией на пластинках с силикагелем в системе хлороформ— этанол (100 3) [9]. После высушивания пластинку помещают в пары НС1, при этом желтые пятна превращаются в красные или голубые (рис. 14.3). Успешная идентификация ДАБТГ-производных аминокислот в значительной степени за- [c.422]

Обычно мы готовим образцы к анализу на секвенаторе лиофилизацией их из воды, разбавленных растворов кислоты, летучих водных буферов. Образцы хранятся в закрытых сцин-тилляционных баночках в виде белого пушистого порошка. В нашей практике бывали случаи, когда образцы, не имевшие такого внешнего вида, не удавалось анализировать. Причины подобных неудач не ясны, но, возможно, они связаны с нерастворимостью образца и наличием в нем примесей. Из-за трудностей идентификации остатков цистеина большинством обычных методов определения ФТГ-производных аминокислот почти всегда перед анализом последовательности мы восстанавливаем и карбоксиметилируем наши образцы радиоактивными реагентами. Поэтому небольшая аликвота каждого определяемого ФТГ-производного проверяется на наличие радиоактивности. [c.426]

Рнс. 4.9. Реакция аминокислоты с 1-фтор-2,4-динитробензолом (реагентом Сенгера). Реагент назван в честь нобелевского лауреата (1958 г.) биохимика Фредерика Сенгера, который использовал его для определения первичной структуры инсулина. Вначале арилируют (с количественным выходом) всех свободные аминогруппы, после гидролиза пептида образуются 2,4-динитрофенил-производные аминокислот, обладающие яркой желтой окраской. Количественный анализ этих производных осуществляют спектрофотометрическими методами. С динитрофторбензолом реагируют также Е-аминогруппа лизина, имидазольная группа гистидина, ОН-группа тирозина и 8Н-группа цистеина. Динитрофе-нильные группы не отщепляются при кислотном гидролизе и используются для идентификации N-кoнцeвыx аминокислот в полипептидах. [c.38]

К настоящему времени подобраны стационарные фазы, позволяющие разделять методом ГЖХ ГАС практически любого класса и решать самые сложные стрз ктурные проблемы, вплоть до установления оптической конфигурации молекул (например, аминокислот [164], изоирепоидных жирных кислот и их эфиров [269]. Получены необходимые для идентификации экспериментальные данные по параметрам удерживания характерных для нефтей летучих ГАС, в том числе тиолов [270], диалкилсульфидов [271], тиацикланов [272], аминов [273, 274], производных пиридина и хинолина [274—276], свободных жирных [277] и ароматических [278] кислот и их метиловых эфиров, фенолов [279, 280], кето-нов [281], спиртов [282] и т. д. Выведены корреляции между хроматографическим поведением и строением ГАС отдельных типов. Надежность идентификации чисто газохроматографическими средствами можно значительно повысить путем изучения так называемых спектров хроматографического удерживания [283]. На основе характеристик удерживания идентифицирован, например [c.34]

Смотреть страницы где упоминается термин ФТГ-производные аминокислот идентификация: [c.694] [c.167] [c.167] [c.76] [c.386] [c.121] [c.678] [c.495] [c.121] [c.214] [c.279] [c.399] [c.399] [c.408] [c.419] [c.430] [c.451] [c.49] [c.41]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология