Электропорация

Электропорация — создание микропор в клеточных мембранах (для переноса фрагментов ДНК) под действием кратковременных мощных электрических импульсов. [c.195]

Электропорация. Метод основан на повышении проницаемости биомембран за счет действия импульсов высокого напряжения. В результате молекулы ДНК проникают в клетки через поры в клеточной мембране. [c.149]

Электропорация Слияние липосом [c.380]

Электропорация. Этот метод основан на том, что импульсы высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомембран. Для растительных протопластов процедура электропорации оказалась очень эффективной. Метод состоит в следующем на растительные протопласты, находящиеся в растворе большой концентрации, содержащем ДНК-векторы, действуют высоковольтным импульсом (напряжение 200—350 В, длительность импульса 54 мс). В результате молекулы ДНК поглощаются клетками через поры в клеточной мембране. После разведения раствора протопласты высеваются на соответствующую среду для регенерации. Эффективность переноса определяется через 24—48 ч после электрошока. [c.61]

Т. у дрожжей м. б. осуществлена только искусственным путем. Для этой цели используют протопласты шш обрабатывают клетки солями щелочных металлов. ДНК проникает в дрожжевые протопласты также под действием электрич. разрядов (т.наз. электропорация). [c.626]

Открываются пути привнесения дополнительной генетической информации по желанию экспериментатора в целях создания трансгенных растений. Прямой перенос чужеродной ДНК в протопласты возможен также с помощью микроинъекции, трансформации, упаковки в липосомы с последующим их эндоцитозом растительными протопластами, и электропорации (высоковольтных электрических импульсов). [c.518]

ДНК, используют для трансформации бактериальных клеток специальных штаммов Е. oli. Трансформация бактерий плазмидами векторов основана на способности клеток акцептировать внутрь себя молекулы ДНК (компетентности). Трансформацию клеток Е. oli обычно проводят одним из двух методов с помощью кальциевого шока или электропорацией. В обоих случаях бактериальная мембрана становится более проницаема для молекул ДНК, последние входят в протоплазму бактериальной клетки. [c.37]

Для увеличения проницаемости клеточных мембран на них воздействуют электрическим током. Эта процедура называется электропорацией. Условия ее проведения различаются для разных видов бактерий. При работе с Е. соП клеточную суспензию ( 50 мкл) и ДНК помешают в сосуд с погруженными в него электродами и подают единичный импульс тока длительностью -4,5 мс (емкость конденсатора 25 мкФ, [c.76]

О механизме проникновения в клетку ДНК в процессе электропорации известно очень мало. По-видимому, как и при химически индуцированной трансформации, в результате электрошока в клеточной стенке образуются временные поры, через которые ДНК и проходит в клетку. [c.77]

Векторная система на основе фага Р1, использующаяся для введения в клетки Е.соИ вектора с крупной вставкой (100-300 т.п.н.) с помощью электропорации. [c.550]

Введение ДНК с помощью липосом и трансформация протопластов путем слияния с бактериальными сферопластами, содержащими векторные плазмиды, использовались с переменным успехом [8, 16]. Последний метод оказался относительно неэффективным и более трудоемким, чем трансформация путем химически стимулируемого эндоцитоза или электропорации, и не будет рассматриваться в данном руководстве. Таким образом, в разд. 3.2 и 3.3 мы остановимся соответственно на методах химически стимулируемого поглощения ДНК и электропорации. Микроинъекции могут использоваться для трансформации клеток, а не протопластов и обсуждаются отдельно в разд. 3.4. [c.197]

Микроинъекции и электропорация бьши описаны в разд. 25.5.1. Эти методы можно использовать, однако они, по-видимому, менее эффективны, чем доставка нужных генов в клетки с помош ью вирусов и липосом. [c.264]

Электропорация — метод переноса генов в клетки с помощью электрического разряда, вызывающего образование дополнительных пор в клеточной мембране. [c.468]

Как и следовало ожидать, клинические испытания, по крайней мере по проектам с применением ретровирусов (как два года назад — с применением аденовирусов), были немедленно приостановлены. Означает ли это крах генной терапии с ее надеждами излечивать не только многие наследственные болезни, но и опухоли, психические заболевания и даже инфекции Нет. И вот почему. Эти трагедии показали, что вирусная доставка, хотя и эффективна, но небезопасна. Попытки изменить структуру вирусов, сделать их более миролюбивыми , пока не увенчались успехом. Но есть и невирусные способы доставки генов в клетки — например, с помош ью синтетических химических носителей (маленьких жировых капсул — липосом), физических методов (электропорация, ультразвук, генная пушка ). Наконец, разработаны и испытываются в клиниках методы введения генов непосредственно в кровь, омываюш ую пораженный орган. Так, например, уже пытаются лечить во Франции достаточно распространенное смертельное заболевание — миодистрофию Дюшенна. [c.137]

Электропорация. Нри исследовании электропорации обычно используют короткие импульсы прямоугольной формы. Для расчета трансмембранного электрического потенциала, индуцируемого внешним электрическим полем в сферической клетке используют уравнение Максвелла [c.37]

После воздействия электрического импульса, приводящего к образованию в мембране пор, проницаемых для ионов и сахарозы, клетки, как правило, набухают за время от нескольких секунд до нескольких минут. После электропорации в связи с появлением в мембране сквозных пор, концентрации солей и сахарозы в клетке и в среде быстро выравниваются. Однако мембрана клетки остается непроницаемой для макромолекул цитоплазмы, которые поддерживают в клетке избыточное осмотическое давление. Благодаря этому происходит движение воды в клетку, сопровождаемое набуханием. Таким образом, набухание клеток после электропорации имеет коллоидно-осмотическую природу. [c.38]

Трансформация протопластов с помощью электропорации [c.4]

Оптимизация методик электропорации с помощью вре менной экспрессии. ......... [c.4]

Электротрансфекция. Под электротрансфекцией и электротрансформацией понимают введение в клетки чужеродной ДНК. Для проникновения через мембрану ДНК важное значение имеют два фактора образование в мембране пор под действием поля (электропорация), а также наличие у молекулы ДНК заряда, обеспечивающего электрофоретическое движение ДНК в момент приложения импульса. Электрообработка клеток в присутствии ДНК приводит к более сильному повышению мембранной проницаемости, по сравнению с аналогичной обработкой без ДНК. На основании этих данных выдвинуто предположение о том, что взаимодействие ДНК с мембраной при электропорации приводит к повышению эффективного диаметра пор или увеличению их времени жизни. [c.45]

Электрополирование 5/912, 925 Электропорация ДНК 4/1243, 1244 Электропроводиостъ 4/57 5/745. См. также Проводимость металлов 3/97, 98 полупроводников 4/103-108 резин 4/иг-Ш [c.756]

Для трансформации дрожжей обычно используют три способа. В первом случае экзогенную ДНК добавляют к клеткам дрожжей, клеточные стенки которых удалены химически или энзиматически (протопласты) (1). В других случаях клетки перед добавлением чужеродной ДНК обрабатывают ацетатом лития (2) или подвергают электропорации (3). Трансфекцию культур животных клеток осуществляют инкубацией клеток с ДНК, осажденной фосфатом кальция или ДЕАЕ-декстраном (1), либо электропорацией в присутствии очищенной трансфицирующей ДНК (2). Как уже упоминалось в гл. [c.136]

По мере истощения природньгх рыбных запасов все большую роль будет приобретать разведение рыбы в искусственных условиях. Основная цель исследований в этой области — создание рекомбинантных рыб путем трансгеноза. До настоящего времени трансгены вводили микроинъекцией ДНК или электропорацией оплодотворенных яйцеклеток различных видов рыб — карпа, зубатки, форели, лосося и т. д. Поскольку у рыб пронуклеус в оплодотворенной яйцеклетке плохо различим в обычный микроскоп, линеаризованную трансгенную ДНК вводят в цитоплазму оплодотворенных яйцеклеток или клеток эмбрионов, достигших стадии четырех бластомеров. Эмбриогенез у рыб протекает в водной среде вне организма, поэтому в имплантации нет необходимости. Все дальнейшие процессы могут протекать в резервуарах с регулируемой температурой. Выживаемость эмбрионов рыб после микроинъекций довольно высока, от 35 до 80%, а доля трансгенных потомков колеблется от 10 до 70%. Трансген можно обнаружить с помощью ПЦР с использованием либо препаратов эритроцитов зародышей, либо суммарной ДНК. Скрещивая трансгенных рыб, можно вывести трансгенные линии. [c.438]

Электропорация (Ele troporation) Образование пор в клеточных мембранах под действием электрического тока. Через эти поры в клетки проникает чужеродная ДНК. [c.564]

Электрослияние мембран. Явления электрослияния клеток по-видимому тесно связаны с электропорацией мембран. Существуют гипотезы, основанные на сравнительно простых физико-химических моделях и теории устойчивости коллоидов. Действительно, слияние мембран контактирующих клеток можно уподобить коагуляции гидрофобных коллоидных частиц. Современная теории устойчивости, развитая Дерягиным совместное Ландау и независимо — Фервеем и Овербеком, рассматривает процесс слипания как результат совместного действия ван-дер-ваальсовых сил притяжения и электростатических сил отталкивания между частицами, несущими поверхностный заряд (ср. 2, 3). В зависимости от баланса сил в разделяющей частицы тонкой водной пленке возникает либо положительное давление, препятствующее соединению частиц, либо же отрицательное, приводящее к утоньшению водной прослойки и образованию контакта между частицами. [c.38]

Механизм электрослияния представляют следующим образом. Под действием внешнего электрического поля в зоне контакта клеточных мембран происходит образование коаксиальных пор, через которые проходит ток. Силовые линии электрического поля распределены таким образом, что возникает давление, сближающее мембраны и замыкающее кромки пор. Нри замыкании кромок пор контактных мембран образуется мембранная трубка, соединяющая цитоплазму сливающихся клеток. Вызванное электропорацией набухание клеток вызывает натяжение мембран, благодаря которому происходит увеличение периметра межклеточной перемычки и полное перемешивание цитоплазмы клеток. [c.41]

ДНК липосомами, тенями эритроцитов или протопластами) г) физический (с помощью микроинъекций или электропорации). Метод слияния развит в настоящее время недостаточно хорошо. Микроинъекции ДНК использовали во многих экспериментах в биологии развития позвоночных [535], но при этом, как правило, нужно вводить очень большое и трудно контролируемое количество материала. В настоящее время наиболее перспективным представляется перенос, связанный с использованием ретровирусов единичные копии можно включить в один (хотя и случайный участок почти в 100% клеток-мишеней. Кроме того, в этом случае известна структура встраиваемой последовательности. На рис. 9.5 показана одна из используемых систем-вирус Молони (вирус лейкемии мышей). На рис. 9.6 представлена схема эксперимента. [c.169]

В некоторых случаях мембранный потенциал в живой клетке может быть выше и достигать 0,2 В (пресноводные водоросли, бактерии, энергизированные митохондрии). В возбудимых нервных и мышечных клетках происходит кратковременная реполяризация мембраны с ростом амплитуды потенциала. Однако пробой клеточной мембраны собственным мембранным потенциалом маловероятен. В то же время рост мембранного потенциала в результате воздействия внешним электрическим полем может достигать величины, превышающей пороговую для электрического пробоя. При этом появляются структурные дефекты типа сквозных липидных пор. Разработанная методика электрического пробоя клеточных мембран получила название электропорации и широко применяется в биотехнологии. [c.52]

Стабильность бислойных мембран определяется вероятностью появления пор критического радиуса. Очевидно, что любой фактор, снижающий высоту энергетического барьера, будет увеличивать эту вероятность. К таким факторам следует отнести снижение краевой энергии поры у, рост поверхностного натяжения и рост мембранного потенциала. Как видно на рис. 2.14, рост пробойного напряжения до 1 В сопровождается смещением критического радиуса к значениям меньшим 0,5 нм, что близко радиусам природных ионных каналов клеточной мембраны. Отсюда следует, что электрический пробой сопровождается появлением широкого спектра липидных пор различного радиуса, включая радиусы ионоселективных белковых каналов. В настоящее время метод воздействия внешним электрическим полем является одним из основных в современной биотехнологии. Известно его применение с целью увеличения пористости мембран (электропорация), введения ДНК (электротрансфекция), освобождение клеток от крупных молекул (электропермеабилиза-ция), слияния клеток (электрослияние). [c.54]

Методики выделения протопластов многих видов растений описаны в литературе [26, 32]. На рис. 2.13 представлена общая схема выделения протопластов из растительных тканей. У многих видов культурных растений не определены благоприятные условия для восстановления клеточной стенки и последующего деления выделенных протопластов. В случае других — сообщалось о низкой частоте деления. Отметим, что для трансформации необходимо использовать достаточно жизнеспособные протопласты, чтобы они могли пережить совместное культивирование с агробактериями или физические методы введения ДНК, например микроинъекцию, электропорацию и химически индуцированный эндоцитоз (гл. 3). Напомним, что разработка эффективной системы получения протопластов у ранее неизучен- [c.143]

Доступность относительно больших количеств векторной ДНК с эффективно экспрессирующимися селективными/скрини-руемыми генами возродила интерес к трансформации посредством ДНК, и многие исследователи быстро оптимизировали целый набор методик для достижения эффективной доставки векторной ДНК в растительные протопласты, подразумевающие использование липосом, полиэтиленгликоля и электропорацию [c.198]

Впоследствии оказалось, что методики, использованные ранее для получения эффективной трансформации протопластов Ti-плазмидой, обеспечивают и оптимальное поглощение малых плаз. иидных векторов [9, 11]. В настоящее время эндоцитоз с помощью ПЭГ и электропорация могут быть использованы для эффективного включения малых векторных плазмид в протопласты с частотой трансформации от 10 до 2-10 2 >[15, 31, 38]. Введение векторной ДНК в синхронизированные протопласты, находящиеся в S-фазе и митозе, повышает эффективность трансформации еще в 3—5 раз 25, 30]. Высказано предположе- [c.198]

В разд. 3.2 мы остановимся на том, как определить оптимальные условия для введения векторной ДНК в протопласты в присутствии ПЭГ, оценивая количество используемой ДНК. Поглощение ДНК контролируется с помощью гибридизации, чтобы подтвердить включение векторной ДНК в протопласты. В разд. 3.3 изложены методики электропорации протопластов и оценки эффективности процесса трансформации путем измерения временной экспрессии DMGT-вектора в клетках, полученных из обработанных протопластов. Трансформация протопластов путем микроинъекций описана в разд. 3.4. [c.203]

Молекулярная биотехнология принципы и применение (2002) -- [ c.76 , c.77 , c.136 ]

Биофизика Т.2 (1998) -- [ c.37 ]

Генная инженерия растений Лабораторное руководство (1991) -- [ c.198 , c.212 , c.221 ]

Основы генетической инженерии (2002) -- [ c.189 , c.202 , c.203 , c.227 , c.363 , c.382 , c.393 ]

Гены и геномы Т 2 (1998) -- [ c.258 ]

Генетическая инженерия (2004) -- [ c.33 , c.84 , c.239 , c.337 ]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология