Нуклеиновая кислота для осаждения

Процесс очистки состоит в выделении данного фермента из грубого клеточного экстракта, содержащего множество других компонентов. Небольшие молекулы удаляются диализом или гель-фильтрацией нуклеиновые кислоты—осаждением путем добавления антибиотика стрептомицина и т.д. Основная проблема—отделить нужный фермент от сотен химически и физически сходных белков. [c.69]

Верхнюю фракцию осторожно отсасывают с помощью шприца в колбу. Повторяют обработку хлороформом и изоамиловым спиртом еще 2—3 раза, пока раствор нуклеиновых кислот не станет прозрачным. Полученный раствор отсасывают и медленно выливают в стакан с двойным объемом охлажденного 96%-ного этилового спирта, помешивая при этом спирт круговыми движениями. Выпадают белые спиралевидные образования — нуклеиновые кислоты. Для более полного осаждения раствор переливают из стакана в стакан. Спиралевидные нити осторожно переносят палочкой в стакан с небольшим количеством 70%-ного этилового спирта, повторяя операцию 2—3 раза с новыми порциями спирта. Затем нуклеиновые кислоты промывают сначала смесью спирт—эфир (1 1), затем эфиром и оставляют сушиться при комнатной температуре. [c.167]

Растворимость биополимеров в воде в значительной мере определяется их способностью к гидратации. У глобулярных водорастворимых белков высокий уровень гидратации обеспечивается предпочтительным расположением на их поверхности гидрофильных групп. У нуклеиновых кислот важным фактором, способствующим гидратации, является наличие в нейтральной и щелочной среде отрицательно заряженных остатков фосфорной кислоты. Добавление органических растворителей понижает степень гидратации и приводит к осаждению гидрофильных биополимеров. Так, для осаждения белков используется добавление к их водным растворам ацетона. Нуклеиновые кислоты осаждаются добавлением этанола. [c.233]

Поскольку вирусы во многом сходны с нуклеиновыми кислотами, мы приведем здесь лишь несколько примеров их очистки или фракционирования. Вирусные частицы легко отделить от различных низкомолекулярных примесей [82, 83], в том числе и от протами-на, который используют для осаждения, например, вируса полиомы. После растворения в крепком растворе поваренной соли вирус можно отделить от белка на сефадексе 0-75 [84] (см. также [77, 78]). Однако для разделения различных вирусов ввиду их значительных размеров необходим гель с максимальными размерами пор (см. гл. И). Для этого может служить гранулированный [85] или сферический [86, 87] гель агара, а также специальное пористое стекло [88]. Палочкообразные вирусы в таком случае распределяются [c.223]

Осаждение белков фенолом с целью их удаления (депротеинизация) получило широкое распространение при выделении и очистке нуклеиновых кислот и специфических полисахаридов. К числу последних относятся вещества, от которых зависит принадлежность крови человека к той или иной группе (изоантигены системы ABO). [c.67]

Изучение структуры и свойств белков и нуклеиновых кислот шагнуло далеко вперед после создания совершенных методов их выделения и очистки. Помимо ранее широко применявшихся методов осаждения, кристаллизации и диализа, для этой цели стали использоваться методы электрофореза, хроматографии, сорбции и противоточной экстракции. Ввиду того что природа биополимеров как полиэлектролитов проявляется во всех физико-химических процессах, возникает необходимость рассматривать электрохимические свойства белков и нуклеиновых кислот, что удобнее всего осуществлять с помощью потенциометрического титрования. [c.5]

Основные успехи разделения биополимеров в гетерогенных системах достигнуты при использовании равновесия между раствором и твердой фазой. Одними из наиболее ранних приемов, сохранивших свое значение и до настоящего времени, являются методы осаждения и кристаллизации. Еще большее значение в настоящее время играют процессы сорбции и их динамическая модификация — процессы хроматографии. Одноактная сорбция белков на окислах металлов и других минеральных сорбентах служит для очистки белков и ферментов уже несколько десятилетий. К этим процессам присоединилась избирательная сорбция белков ионообменными смолами. Одним из наиболее значительных достижений современной физической химии в области фракционирования сложных смесей веществ, в частности белков, нуклеиновых кислот, полипептидов, аминокислот и нуклеотидов, явилась хроматография, особенно в виде ее ионообменной модификации и гельфильтрации на сефадексах. [c.7]

Известны случаи относительно избирательного осаждения ряда белков при значениях pH, довольно далеких от изоточки, но обеспечивающих образование нерастворимых комплексов с некоторыми биополимерами, присутствующими в смеси. Так, первичная очистка ряда бактериальных токсинов и анатоксинов (дифтерийного, ботулинического, столбнячного) достигается осаждением при pH 3,5- -4,0 — промежуточном по отношению к изоэлектрическим точкам этих белков и нуклеиновых кислот, содержащихся в культуральной жидкости. В этих условиях молекулы указанных белков и нуклеиновых кислот обладают противоположными зарядами и легко образуют нерастворимые соединения. [c.18]

При наличии в растворе ДНК ацетата магния с концентрацией 0,005 М и при концентрации ДНК — 0,03 мг в 1 мл 0,14 М ацетата аммония с pH 7,0 фракция I ДНК выпадает в раствор при добавлении этанола в количестве, равном 0,87 0,02 объема раствора до добавления спирта. Зона перехода между началом и концом осаждения ДНК фракции I очень узкая — практически она соответствует двум-трем каплям спирта на 60 мл испытуемого раствора ДНК (известно, что в титрационных методах анализа целесообразно иметь по возможности более узкую зону перехода). Осадок ДНК фракции I отделяли центрифугированием и к маточному раствору добавляли равный объем 95%-ного этанола. После стояния смеси в течение ночи на холоду выпадала фракция II нуклеиновых кислот. Фракции I и II переосаждали 2—3 раза спиртом из раствора в ацетате аммония. Для удаления примеси свободной РНК из полученных двух фракций ДНК их обрабатывали активированным углем, который адсорбирует свободную РНК [13] и, по нашим данным, заметно не адсорбирует комплексы ДНК с РНК, если активированный уголь брать в количестве не более 2—3% от объема раствора. [c.46]

Далее, как видно на том же рисунке (рис. 1, кривая 2), при помощи фракционированного осаждения с применением КОН + ТХУ радиационно-биохимические изменения в нуклеиновых кислотах выявляются также уже тотчас после облучения. Относительное содержание фракции ДНК, наиболее легко осаж- [c.47]

Изменения во фракциях нуклеиновых кислот и в остаточном белке костного мозга тотчас после локального облучения дозой 2000 р (даны значения для облученной пробы в процентах от нормы. Осаждение с этанол) [c.48]

Данные таблицы показывают, что для отчетливого выявления изменений в ДНК и РНК тотчас после облучения большое значение имеет не только фракционирование нуклеиновых кислот, но и метод их выделения. Мы применяли метод фракционированного осаждения нуклеиновых кислот спиртом в присутствии ацетата Mg . Деполимеризация ДНК и РНК тотчас после облучения костного мозга выявляется только в том случае, если ДНК и РНК выделяли без применения додецилсульфата натрия. До- [c.48]

I — вязкость нуклеиновых кислот головного мозга 2 — фракционированное осаждение ДНК головного мозга ТХУ нз раствора в 1 н. КОН 3 — фракционированное осаждение ДНК костного мозга ТХУ из раствора в 1 н. КОН [c.51]

Нуклеиновокнслый натрий получают щелочным гидролизом д южжей, с 1 0 стедующим осаждением нуклеиновой кислоты соляной кислотой и спирто Очистку производят промыванием водой. Натриевая соль нуклеиновой кнс лоты получают ней.1)ализацией ее раствором едкого н гра и осаждением спиртом. [c.187]

Очистку плазмидной ДНК от примеси РНК (после осаждения ДНК бактерии-хозяина из просветленного лизата ) можно осуществлять в препаративном варианте на колонке оксиапатита и без участия бромистого этидия, но в присутствии 8 М мочевины, что обеспечивает сохранение однонитевой структуры РНК. Окси-апатит (1 г на 1 л лизата бактерий) суспендировали в 0,2 М Na-фосфатном буфере (pH 6,8) с добавлением до 8 М мочевины и заполняли им широкую колонку. Освобожденный от ДНК хозяина лизат без какой-либо дополнительной очистки разбавляли в соотношении 9 1 0,27 М Na-фосфатным буфером (pH 6,8) с 9 М мочевиной и 0,9% ДДС-Na и вносили в колонку. Ее промывали сначала тем же раствором, но без ДДС-Na, потом 0,01 М Na-фосфатным буфером без мочевины (при этой промывке сорбент один раз взмучивали и снова давали ему осесть). Все белки и РНК выходили из колонки в ходе промывок. Плазмидную ДНК элюировали 0,3 М Na-фосфатным буфером. По данным авторов, ее выход сильно варьировал от одной партии оксиапатита к другой. Из больших объемов бактериальных лизатов все нуклеиновые кислоты целесообразно сначала осадить этанолом. Показано, что разрывы в плазмидной ДНК в ходе очистки на оксиапатите не появляются [ olman et al., [c.239]

РНК чаще всего получают обработкой препарата фенолом, насыщенным водой, в котором осаждаются все белки. При определенных условиях иногда удается удалить и ДНК. Последовательные стадии осаждения и экстрагирования позволяют отделить РНК от полисахаридов (в водном слое), ДНК (если она имеется) и других компонентов [111 —113]. Нуклеиновые кислоты можно отделить от белков, удаляя последние с помощью протеолнтических ферментов. [c.159]

На первой стадии разрушают биологический материал. Обычно начинают с разрезания и затем механического размельчения в гомогенизаторе. Для разрыва клеточных стенок используются различные методы обработка ультразвуком, встряхивание со стеклянными шариками, растирание замороженного материала в ступке, осмотический шок, осмотический лизис дистиллированной водой, обработка поверхностно-активными веществами илн воздействие протеазами. Нежелательные составные части клеток могут быть отделены центрифугированием, нуклеиновые кислоты отделяют осаждением протаминсульфатом, углеводы — электрофорезом, липиды — низкотемпературной экстракцией органическими растворителями. [c.346]

Для осаждения, концентрирования и фракционной очистки ферментов могут быть использованы полиакриловые кислотьт, способтп,1е образовывать растворимые комплекст т с ферментным белком в области pH 3,0—5,8. Метод дает возможность эффективно разделять фермен-тт>т от полисахаридов и нуклеиновых кислот (511. [c.169]

Трихлоруксусная кислота, ТХУ (Tri hlora eti a id) Органическое соединение, часто использующееся для осаждения белков и нуклеиновых кислот. [c.562]

После того как РНК и ДНК разделены нри помощи метода Шмидта—Таннгаузера или метода Огура — Розен, количество пуринов и пиримидинов, а следовательно, и количество нуклеиновых кислот в каждой фракции легко определить при помощи кварцевого спектрофотометра, измеряя поглощение в ультрафиолете [21, 38, 39]. При этом следует соблюдать некоторые меры предосторожности [41]. При проведении подобного рода измерений для экстрагирования и осаждения рекомендуется использовать хлорную кислоту, поскольку у нее поглощение в ультрафиолетовой области менее выражено, чем у трихлоруксусной кислоты (последняя характеризуется значительным поглощением в области 260 ммк). [c.104]

Чтобы разработать методы использования нуклеиновой кислоты, нуклеотидов, аминокислот и фосфатов, значительная часть работы К. Нойберга была повторена и подтверждена [17]. Необычные эффекты растворения были ползпгены при использовании 0,2 М растворов Ка-АТФ на определенные навески свежеосажденных соединений. Исследование более 200 таких образцов полностью подтвердило выводы К. Нойберга и его сотрудников. Субстраты готовились осаждением солей металлов, которые после промывки дистиллированной водой концентрировались в центрифуге и затем помещались в 0,2 М раствор Ка-АТФ. Величина pH во всех случаях поддерживалась около 7,5. Получив прозрачный раствор, исследователи выяснили, что добавлением применяемых реагентов не удается достигнуть повторного осаждения этих соединений, которые остаются в растворе вплоть до разложения Na-ATФ. Для проверки этих удивительных результатов применительно к разным породам природные минералы были измельчены в порошок и помещены в 0,2 М раствор Ма-АТФ (табл. 4). Разница получилась очень незначительная, что подчеркивает возможности нуклеиновых кислот и нуклеотидов как растворителей при природной седиментации и цементации в более или менее нейтральных или естественных условиях. [c.34]

Для определения молекулярного веса ДНК (обзоры — см. наиболее широко используются методы, основанные на определении скорости седиментации макромолекул. Это определение может быть выполнено по различным методикам наиболее широкое распространение в последнее время приобрела методика, основанная на зональном центрифугировании в градиенте плотности сахарозы в препаративной ультрацентрифуге В данном случае распределение веществ по скорости осаждения можно контролировать по радиоактивной метке, что обеспечивает высокую чувствительность с другой стороны, методика практически без изменений может быть применена и для препаративного разделения нуклеиновых кислот. Предложен ряд эмпирических уравнений, связывающих скорость седиментации двухцепочечного комплекса ДНК со значением молекулярного веса определенным независимыми методами. Последнее из этих уравнений охватывает пределы мол. веса 0,2— 130 108. [c.30]

Нуклеиновые кислоты, которые связаны с белками связями солевого типа, можно удалить, осаждая их белком, обладающим выраженными основными свойствами, т. е. содержащим большое количество положительно заряженных групп (аргинина, лизина). В качестве такого белка может быть использован, например, нротамин. Однако осаждение должно выполняться при таких значениях pH, когда только нротамин образует солевое соединение с нуклеиновой кислотой, т. е. при pH, превышающих изо-электрическую точку белка, но более низких, чем изоэлектричес-кая точка протамина. Весьма эффективный способ удаления нуклеиновых кислот — это расщепление их ферментами типа нуклеаз (РНК-азой и ДНК-азой). Разумеется, должны быть подобраны такие условия, которые не приводили бы к разрушению основного выделяемого фермента. [c.144]

Впервые идея о применении значительной центробежной силы для осаждения и определения размеров коллоидных частиц была высказана и опробована на практике еще в 1913 г. Думан-ским. Однако потребовались долгие годы теоретических и практических изысканий, прежде чем Сведбергрм (1940 г.) были разработаны теоретические основы данного метода и создана первая ультрацентрифуга со скоростью вращения ротора до 65 ООО об1мин. К настоящему времени методы аналитического и препаративного ультрацентрифугирования получили широкое применение в исследованиях белков и нуклеиновых кислот и при изучении структурных элементов клетки. [c.142]

Методы фракционирования включают осаждение нейтральными солями [19—21], электрофорез [22, 23], хроматографию на фосфате кальция [24—26] и осаждение дигидрострептомицином [27]. Недавно для фракционирования рибонуклеиновых кислот была использована фракционная диссоциация комплексов нуклеиновая кислота — гистон, примененная ранее к дезоксинуклеиновым кислотам [28]. Во всех фракциях отношение 6-амино- к 6-кетонуклео-зидам было близко к единице. В некоторой степени фракционирование происходит при экстракции фенолом [29—32], возможно как результат дифференциального связывания нуклеиновых кислот с белками. Анионообменные целлюлозы, такие как ЭКТЕОЛА и ДЭАЭ, широко применяются в настоящее время для фракционирования не только рибонуклеиновых кислот [33, 34], включая специфичные для аминокислот транспортные РНК [35], но и рибонуклео- [c.365]

Некоторая степень очистки [58] транспортных РНК, специфичных для валина и пролина, достигается при применении фракционного осаждения спермином при pH 5,6. Значение pH весьма критично исследования [59] синтезированных ферментативным путем гомополимеров (из которых все осаждаются при pH между 4,1 и 6,8) и их спиральных комплексов указывают, что, тогда как комплекс полиадениловой и полиуридиловой кислот осаждается спермином при pH от 5,1 до 6,8, аналогичный комплекс полиипозиновой и поли-цитИдиловой кислот со спермином растворим в этих пределах pH. Одпако при подкислении до pH 4,5 происходит немедленная агрегация, вероятно вследствие разрушения спирального комплекса протонированием цитозиновых остатков. Результаты позволили предположить довольно заметную гетерогенность состава (или, возможно, структуры) транспортных нуклеиновых кислот. [c.367]

Гистоны также представляют собой белки, обладающие основными свойствами. Эти белки были открыты Косселем [184] в ядрах клеток, где они находятся в соединении с нуклеиновыми кислотами. Основной характер выражен у гистонов слабее, чем у протаминов, вследствие чего они не осаждаются щелочными растворами пикратов. Возможно, что гистоны являются предшественниками протаминов, так как они были найдены в семенниках неполовозрелых рыб. В силу своего щелочного характера гистоны осаждаются из растворов аммиаком при изоэлектрической точке (около pH 8,5). Это свойство используется при выделении гистонов. Подробнее всего изучен гистон из зобной железы. Для получения этого гистона измельченная зобная железа настаивается с водой, после чего к водному экстракту железы прибавляют уксусную кислоту. При этом выпадает осадок ну-клеогистона, который растворяют в щелочи. Нуклеиновые кислоты удаляют осаждением серной кислотой, а образующуюся сернокис-яую соль гистона осаждают из фильтрата этиловым спиртом [185]. Гистоны имеют более высокий молекулярный вес, чем протамины, и аминокислотный состав гистонов ближе к аии- [c.198]

Препараты нуклеиновых кислот первоначально получали путем экстрагирования щелочами с последующим осаждением кислотами. Под воздействием кислот и щелочей макромолекулы нуклеиновых кислот, однако, меняются и их растворы при pH < 5,6 и > 10,9 [256] теряют характерную для них высокую вязкость, что обусловлено, вероятно, дезагрегацией макромолекул. Дезагрегация обладающих высокой вязкостью полимерных нуклеиновых кислот вызывается также действием двух ферментов рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы [257, 258]. Оба фермента были выделены Кунитцом из поджелудочной железы в кристаллической форме (см. гл. XII). [c.260]

Проведенные нами исследования показали, что наиболее отчетливо радиационно-биохимические изменения в нуклеиновых кислотах сразу после рентгеновского облучения in vivo могут быть выявлены при помощи фракционированного осаждения нуклеиновых кислот при определенном способе их выделения. Основное внимание в нашей работе было уделено разработке методов отчетливого выявления изменений в ДНК и РНК непосредственно после облучения in vivo. [c.45]

Облучению подвергали правую заднюю конечность кролика. Остальную часть тела экранировали свинцом. Левая конечность служила контролем. Дозы облучения в одной серии опытов 2000 р, в другой — 200 р. ДНК и РНК выделяли совместно при помощи двухкратной денротеинизации щелочным фенолом с pH 8,3 [3]. Растворы нуклеиновых кислот диализовали для удаления фенола. Фракционированное осаждение нуклеиновых кислот проводили или трихлоруксусной кислотой из щелочного раствора [3], или спиртом в присутствии соли магния из нейтрального раствора. Метод фракционированного осаждения нуклеиновых кислот спиртом в присутствии соли магния, по-видимому, особенно перспективен в связи с тем, что при этом нет потерь нуклеиновых кислот и, кроме того, сохраняется их нативность. Фракционированное осаждение ДНК спиртом в присутствии соли магния позволяет очень четко разделить ДНК на две фракции легко осаждаемую — фракцию I — и трудно осаждаемую — фракцию П. Для четкого разделения ДНК необходимы следую- [c.45]

Исследовано действие локального рентгеновского облучения конечности кролика на свойства нуклеиновых кислот костного мозга. ДНК и РНК выделяли совместно при помощи щелочного фенола. Методом фракционированного, осаждения с использованием этанола -fMg++ нуклеиновые кислоты разделяли на две основные фракции более легко осаждаемую — высокополимерную фракцию (I) и более трудно осаждаемую — низкополимерную фракцию (II). [c.54]

Распределение ДНК и РНК во фракциях, а также соотношения ДНК РНК и ДНК остаточный белок во фракциях резко отклоняются от нормы как непосредственно досле облучения, так и в последующие дни. При определенных условиях сразу после облучения обнаруживается уменьшение ДНК и РНК во фрак ции I и увеличение их во фракции II. Относительное количество РНК и остаточного белка по сравнению с количеством ДНК во фракции II тотчас после облучения уменьшается по сравнению с нормой примерно в два раза при дозе 2000 р. Полученные данные свидетельствуют о пониженной полимерности ДНК и РНК уже сразу после облучения in vivo. Непосредственно после локального облучения конечности животного дозой 2000 р отношения аденин цитозин и гуанин цитозин увеличиваются в ДНК фракции II облученного костного мозга на 40—41 % по сравнению с нормой. Изменения в составе оснований ДНК фракции II отмечены и сразу после локального облучения дозой 200 р. Через одни — шесть суток после облучения полимерность ДНК особенно сильно снижается, а относительное количество РНК и белка в нефракционированных препаратах нуклеиновых кислот по сравнению с нормой увеличивается. На основании полученных данных можно прийти, к заключению, что нарушение комплексов биополимеров весьма существенно для лучевого поражения организма. Разработанные нами методы фракционированного осаждения нуклеиновых кислот позволяют обнаружить их изменения сразу после облучения in vivo более отчетливо, чем ранее, применявшиеся методы. [c.54]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология