Рестрикты

Ларсон и соавторы в аналитических опытах на микроколонке (0,15 X 10 см) исследовали оптимальные условия для фракционирования рестриктов ДНК в системе ХОФ-5 при среднем давлении ( 33 атм) и скорости элюции 13 мл/ч. Наилучшее разделение 17 фрагментов размерами от 43 до 850 пар оснований получалось у них при использовании очень пологого линейного градиента (0,55—0,75 М K I) объемом 40 мл (220 Fj) в нейтральном буфере при температуре 43°. Повышение температуры, по их данным, затрудняет элюцию ДНК и растягивает ее профиль. Удается разделить фрагменты длиной 98 и 102 пары оснований, чего далеко не всегда можно добиться с помощью электрофореза. Длина липких концов рестриктов и их состав влияют на разделение, равно как и нуклеотидный состав ДНК и даже последовательность оснований. Подчеркивается нео - [c.173]

ПОЛУЧЕНИЕ РЕСТРИКТОВ ДНК ФАГА % И РАЗДЕЛЕНИЕ [c.175]

Проведение электрофореза. Наносят в лунки геля смесь рестриктов ДНК фага X и анализируемый образец ДНК (0,05—5 мкг в зависимости от гомогенности образца). Электрофорез проводят в течение [c.175]

Измерив подвижность всех рестриктов ДНК, строят график зависимости относительной подвижности от логарифма молекулярной массы. [c.176]

Участки ДНК, по которым происходит расщепление той или иной рестрикта-зой, называют сайтами рестрикции. Поскольку эндонуклеазы рестрикции используются не только для подготовки ДНК к секвенированию, но и для других целей, в частности для генной инженерии (см. 7.11), распределение сайтов рестрикции вдоль молекулы ДНК является важной характеристикой ДНК. Установление взаимного расположения этих сайтов называют физическим картированием ДНК, а саму схему такого распределения — физической картой ДНК. [c.276]

Рестрикты (особенно — с липкими концами) могут быть сшиты с помощью ДНК-лигаз При необходимости липкие концы отжигают (отжиг—это специфическая реассоциация комплементарных цепей с образованием двухцепочечных молекул) [c.193]

Рис 67 Схема выделения фраг ментов ДНК из смеси рестриктов ДНК по Саузерну 1 — расщепление [c.195]

Рис. 19.6. Блоттинг по Саузерну позволяет осуществить прямое выделение фрагментов ДНК, соответствующих специфическому зонду, из смеси рестриктов ДНК генома.

Клонирование фрагментов, полученных путем механического дробления, сопряжено с рядом технических трудностей в вектор легче встроить рестрикт. Однако сложность такого встраивания состоит в том, что сайты рестрикции могут находиться в неудобных местах, например в середине гена, который надо клонировать. Один из способов преодоления этой трудности состоит в использовании более чем одной рестриктазы, т.е. в повторении эксперимента с различными ферментами, сайты узнавания которых занимают разные положения. Но это требует дополнительного времени, и при работе с длинной последовательностью бывает сложно найти фермент, не разрезающий ее. [c.243]

Поэтому для создания удобной библиотеки путем клонирования рестриктов пользуются приемом, так регулирующим частоту внесения разрывов, чтобы получились более длинные фрагменты. Для этого используют фермент с короткой (4 п. н.) последовательностью узнавания в условиях, обеспечивающих частичную рестрикцию [c.243]

Рис. 20.8. При наличии интрона между двумя сайтами рестрикции размер соответствующего рестрикта увеличивается.

Рис. 20.9. Наличие вставочной последовательности приводит к образованию дополнительных рестриктов в том случае, когда она содержит сайт рестрикции для специфического фермента.

Используя фрагменты рестрикции, соответствующие определенным участкам структурного гена, можно определить, имеют ли они сходство с другими нуклеотидными последовательностями генома. Клонированный рестрикт может быть использован в качестве зонда при гибридизации со всей ДНК генома для определения частоты его повторяемости или для обнаружения соответствующей последовательности в наборе рестриктов. Для этого можно использовать фрагменты, представляющие как экзоны, так и интроны. [c.255]

При метилировании бактериальной ДНК в соответствующих сайтах она становится иммунной к рестрикта-зам (рис. 34.1). Такая защита необходима для предотвращения деградации ДНК клетки под действием ее собственных рестриктаз. Однако этот способ защиты не распространяется на любую чужеродную ДНК, входящую в клетку. Она имеет немодифицированные сайты-мишени и поэтому атакуется ферментом рестрикции. Следовательно, комбинация модификации и рестрикции позволяет клетке отличать чужеродную ДНК от своей собственной. [c.432]

МЕТОД СЛУЧАЙНОГО РАЗРЕЗАНИЯ ГЕНОМА РЕСТРИКТА- [c.523]

Рис. 4.60. Обнаружение глобинового гена. ДНК выделяют из любого препарата клеточных ядер, в ее составе имеются глобиновые гены. Различные рестрикционные эндонуклеазы (рестриктазы) расщепляют ДНК на множество фрагментов (рестриктов), узнавая специфические последовательности нуклеотидов. Фрагменты разделяют по размеру с помощью гель-электрофореза. Готовят специфический радиоактивный зонд на глобиновый ген и гибридизуют его с фрагментами ДНК Радиоактивный сигнал обнаруживают с помощью радиоавтографии [1252].

И ча с М,, Биологический код, пер, с англ,, М., 1971. ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ (генетич. инженерия), совокупность методов, позволяющих искусственно получать молекулы ДНК, содержащие генетич. информацию из двух или более источников любого биол. и (или) хим. происхожде-пия. Осп. этапы Г. и. I) фрагментация молекул ДНК из ра, л. источников (бактерий, вирусов, культуры клеток, ткапей, целых организмов), обычно с помощью рестрикта-зы, или искусств. х1[мико-ферментативный синтез фрагмента ДНК 2) расщепление с номогцью этого же фермента молекулы ДНК (вектора), способной автономно реплицироваться в клетке (обычно это плазмидная или вирусная ДНК) 3) соединение фрагментов ДНК с вектором в еди- [c.125]

Описанный подход люжно использовать и для очистки рестриктов ДНК, содержащих определенную последовательность, из продуктов переваривания рестриктазами суммарных нативных ДНК или для оценки содержания определенных генов в исследуемой ДНК путем титрования избытком меченой кДНК. Авторы отмечают, что аналогичные задачи решались путем гибридизации с НК, сорбированными на целлюлозе. Однако гибридизация с участием иммобилизованных НК идет хуже, а при последующем плавлении гибридов с матрицы могут частично сниматься и пе закрепленные ковалентной связью молекулы, по которым идет отбор. [c.439]

Получение рестриктов ДНК фага X. 2 мкг ДНК фага % растворяют в 20 мкл раствора № 1, добавляют рестриктазу Hind III (2— [c.175]

Интенсивность окраски бромистым этидием зависит от размеров рестриктов зоны крупных рестриктов удается выявить при наличии 30—50 нг в полосе. Для выявления мелких рестриктов необходимо иметь 200—500 нг фрагмента ДНК в каждой полосе. Поэтому для обнаружения всех фрагментов, образующихся при обработке ДНК фага "К рестриктазой Hind П1, необходимо наносить на гель образцы с минимальным (0,3—0,5 мкг) и максимальным (2—5 мкг) количеством ДНК. В последнем случае удается выявить все зоны рестриктов, при этом полосы крупных рестриктов выявляются в виде сильно перегруженных зон, а полосы средних и мелких по размеру рестриктов — в виде тонких, четко разделенных полос. [c.176]

ДНКаза I из поджелудочной железы Эндонуклеаза (рестрикта-за) E oRI из . соИ [c.14]

Для удаления созданного дополнительного рестриктного сайта синтезированная ДНК расщепляется соответствующей рестрикта-зон, образующиеся выступающие одноцепочечные последовательности удаляются действием Si-нуклеазы Asp- огугае и тупые концы молекулы соединяются с помощью Т4 ДНК-лигазы. Разбнвка последовательности ДНК на модули проводится произвольно- [c.374]

В настоящее время рестриктазы подразделяют на три класса с )гчетом RMS-системы, в которой RMS — белки рестрикции, метилирования (модификации) и посадки соответственно К первому из них относят те рестриктазы, которые расщепляют ДНК в произвольных точках с образованием различных фрагментов ДНК (для обеих нитей ДНК известны системы R2M2S), ко второму классу (их известно около 500) относят ферменты, для которых сайты рестрикции и посадки совпадают — RS и MS Образующиеся при этом фрагменты (рестрикты) воспроизводятся по длине Рестриктазы этого класса, объединяющие рестриктазы вышеуказанных трех групп, преимущественно использзшэтся на практике Рестриктазы III класса (например из фага Р1, системы 2R MS) объединяют все прочие рестрикционные эндонуклеазы Отдельные из них, например, не узнают сайтов посадки Их редко используют на практике [c.189]

При молекулярном клонировании (рис. 15.21) используют плазмиды в качестве переносчиков (векторов) для введения в бактериальную клетку и репродукции в ней чужеродной ДНК, которая может быть даже эукариотического происхождения. Для этой цели плазмиду и соответствующую чужеродную ДНК обрабатывают специфической рестрикта-зой, например E oRL В результате из обоих препаратов ДНК [c.469]

Однако при наличии специфического зонда в пятне рестриктов можно обнаружить соответствующие ему последовательности. Последовательность операций такого метода приведена на рис. 19.6. Ключевой момент-денатурация ДНК с образованием одноцепочечных фрагментов, которые переносят из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр, где они иммобилизуются. Процесс переноса ДНК несколько похож на промокание (по-английски-блоттинг), и в разговорной речи этот термин используется для его обозначения. При работе с ДНК такой метод известен под названием блоттинга по Саузерну (Southern blotting) (по фамилии автора метода). [c.243]

При любом методе определения последовательностей ДНК можно получить информацию об участке ДНК, который может быть исследован в пределах одного сек-венирующего геля. Поскольку повторяются различающиеся тандемные копии, невозможно реконструировать более длинные последовательности путем получения перекрывающихся индивидуальных рестриктов. [c.303]

Фаг X также представляет собой хороший пример того, как можно использовать фрагменты, образующиеся при рестрикции (рестрикты) для описания структуры генома вируса. На рис. 9.6 можно видеть число и размеры фрагментов ДНК, образующихся при действии нескольких различных рестриктаз на геном этого фага. Последовательность фрагментов, образующихся при действии определенной рестриктазы, можно определить с помощью сочетания нескольких методов, цель которых состоит в построении карты сайтов рестрикции генома фага X. На рис. 9.7 схематически изображена карта сайтов E o RI и Hin dlll на фоне генетической и физической карт генома фага X. [c.271]

На следующем этапе работы эту пленку помещают в раствор, содержащий так называемый зонд, т.е. одноцепочечные молекулы нуклеиновой кислоты, комплементарные отыскиваемым в библиотеке и содержащие радиоактивную метку. Таким радиоактивным зондом может служить информационная РНК, выделенная из ткани, в которой наиболее активно функционирует интересующий нас ген это может быть также искусственный дезоксиолигонуклеотид, синтезированный так, чтобы отвечать известной последовательности аминокислот в том белке, который кодируется разыскиваемым нами геном наконец, это может быть рестрикт из другого участка клонируемой ДНК. Радиоактивный зонд гибридизирует с комплементарной ДНК на поверхности пленки. Затем с пленки смывают не вступившие в гибридизацию остатки зонда и производят радиавтографию, позволяющую установить, где именно на поверхности пленки, а значит и на поверхности чашки Петри, располагаются негативные колонии, содержащие ДНК, способную гибридизировать с зондом (рис. 9.15). Затем из соответствующих негативных колоний можно выделить фаг, содержащий интересующий нас фрагмент чужеродной ДНК. [c.282]

Препарат линейной вирусной ДНК об абатывают указанными ниже ферментами и их комбинацией. Получившийся набор рестриктов подвергают электрофорезу. На основе представленных в таблице результатов постройте карту рестрикции вирусной ДНК. [c.291]

Типы полиморфизма ДНК. Наиболее распространенный тип полиморфизма ДНК-рестрикционный полиморфизм. Если в сайте узнавания для какой-то рестриктазы происходит точечная мутация, фермент не распознает свой сайт и не разрезает ДНК (рис. 2.84). Имея под рукой специфические ДНК-зонды и рестриктазы, можно анализировать ДНК. Рестрикционные фрагменты ДНК (рестрикты) различаются по длине (полиморфизм по длине рестрикционных фрагментов). Они идентифицируются по различной подвижности после гибридизации по Саузерну (рис. 6.5). В настоящее время метод гибридизации по Саузерну включает радиоактивное мечение. Вероятно, в будущем появится возможность нерадиоактивного мечения фрагментов ДНК. Точечные мутации, заменяющие один нуклеотид на другой в некодирующем районе ДНК, встречаются очень часто. Немногие систематические исследования изменчивости ДНК проводились путем анализа с использованием большого количества рестриктаз в небольшой выборке особей (10 12). Результаты, полученные для хорошо изученных к настоящему времени областей генома (гемоглобина, альбумина и сегментов ДНК с неизвестной функцией из разных хромосом) [1143 1742 1959], свидетельствуют о том, что уровень нуклеотидной изменчивости приблизительно на порядок выше, чем наблюдаемый по структурным генам, кодирующим белки. Это означает, что разница между случайно выбранными хромосомами составляет в среднем 75оо" 7г5о нуклеотидов (гетерозиготность = = 0,001 — 0,004). Особенно подходят для выявления вариантов ДНК ферменты Мер и Тая1, узнающие метилированный динуклеотид СрО. Большинство вариантов по длине рестрикционных фрагментов диморфны, т. е. имеют только два аллеля -присутствие ( + ) или отсутствие ( —) сайта рестрикции. Частота полиморфного ва- [c.288]

Рис. 36.2. Расщепление ДНК рестрииирующими эндонуклеазами (рсстриктазами). В результате рестрикции образуются фрагменты (рестрикты) либо с липкими (А), либо с тупыми ( ) концами.

Оптимальное планирование Оиохими-ческих экспериментов по картированию. Построение физических карт на ЭВМ освобождает экспериментаторов от рутинной и трудоемкой работы и дает возможность получать подробные физические карты (порядка 10 сайтов по каждой рестрикта-эе), построение которых без помощи ЭВМ невозможно. Однако построение физических карт с 10-20 сайтами по каждой рестриктазе (при использовании только информации об одиночных и совместных рестрикциях) сталкивается с серьезньми вычислительньми трудностями даже на современных ЭВМ. В разделе 5.6 обсуждаются возможности дополнительных биохимических экспериментов, которые позволяют иногда обойти математические проблемы построения физических карт за счет получения (довольно трудоемкого) биохимическими методами информации о порядке расположения рестрикционных фрагментов (при использовании таких методов требования к точности определения длин фрагментов снижаются). Привлечение информации о дополнительных биохимических экспериментах дает возможность строить очень подробные физические карты (20-50 сайтов по каждой рестриктазе). Работа с ЭВМ в режиме диалога позволяет свести к минимуму и экспериментальную работу по картированию - при этом минимизируется количество электрофорезов и указывается минимальный набор дополнительных биохимических экспериментов, необходимых для построения физической карты. [c.161]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология