Флуктуационный тест

Флуктуационный тест спонтанного происхождения мутантов Е. соН, устойчивых к фагу Т1 [c.140]

Если Принять во внимание различие самих методов, то можно считать, что определенная таким способом частота мутаций находится в хорошем соответствии с той, которая была получена ранее из результатов флуктуационного теста Лурия и Дельбрюка. Более того, так как общее число [c.142]

Хотя опыты с пересевом значительно проще, чем флуктуационный тест, но и в этом случае полученные результаты нуждаются в статистической обработке. В 1952 г. Джошуа и Эстер Ледерберги смогли наконец показать спонтанную природу бактериальных мутаций с помощью метода, не требующего никакой статистической обработки. Ледерберги провели очень простой, но очень удобный по технологии эксперимент. Они установили, что можно делать отпечаток бактериальных колоний, выросших на чашке с агаром (фиг. 64). Для этого на поверхность агара исходной первичной чашки, содержащей колонии бактерий, накладывают кусок бархата, натянутый на круглую деревянную болванку диаметром, равным диаметру чашки Петри. Затем этим бархатом касаются чистой поверхности агара новой чашки Петри. После инкубации этой второй чашки получается реплика, отпечаток исходной чашки в каждой точке, где была колония на исходной чашке, вырастает колония и на чашке-реплике. [c.143]

Применение флуктуационного теста для анализа рекомбинантов, возникших в независимо развивавшихся культурах бактерий [c.228]

Для определения числа бактерий, выживших при различных временах воздействия, и тем самым для получения параметра D [10, 13] можно также использовать флуктуационный тест. Эксперимент должен быть поставлен таким образом, чтобы во всех пробирках наблюдался рост при самом коротком времени экспозиции и рост отсутствовал бы во всех пробирках в случае наиболее продолжительной экспозиции. Промежуточные времена экспозиции следует выбирать так, чтобы рост имел место в определенной части пробирок. Рекомендуется использовать как минимум три разные температуры. Уравнение для вычисления числа выживших бактерий в пробе имеет вид [c.168]

Принцип флуктуационного теста [c.195]

В то время как значение флуктуационного теста и метода пересева сводится сейчас лишь к тому, что в свое время с их помощью был решен очень важный вопрос, метод отпечатков остается и сейчас одним из наиболее ценных методов в исследованиях генетики бактерий. Метод отпечатков нашел широкое применение при отборе ауксотрофных мутантов, подобных тем, которые были описаны в гл. V. При использовании этого метода для выделения акусотрофов засевают ряд исходных чашек с полной средой, содержащей бульон, так что на каждой из этих чашек после инкубации вырастает несколько сот колоний прототрофных бактерий. Затем с этих исходных чашек делают отпечатки на чашки с минимальной средой. Легко обнаружить присутствие на исходной чашке с полной средой любой редкой ауксотрофной мутантной колонии эти бактерии неспо- [c.143]

Ка к только на рубеже этого века для лечения болезней, вызываемых бактериями, стали использовать лекарственные препараты, сразу заметили, что воздействие на бактериальную культуру того или иного лекарственного препарата часто приводит к тому, что чувствительная к этому препарату культура превращается в форму, устойчивую к нему. Лекарственный препарат, взятый в таких количествах, которые наверняка убили бы исходных, чувствительных бактерий, не оказывал влияния на культуру устойчивых бактерий. С началом широкого использования сульфамидных препаратов (в 30-х годах) и антибиотиков пенициллина и стрептомицина (в 40-х годах) развитие у бактерий устойчивости к лекарственным препаратам превратилось в явление обычное и стало (и все еще остается) проблемой огромной практической важности. При попытках объяснить природу этого явления исходили из широко распространенного тогда мнения, что бактерии приобретают устойчивость к лекарствам только после того, как последние на них подействуют. Одним из наиболее выдающихся защитников этого взгляда был Сирил Хиншельвуд, который развил в своей книге Химическая кинетика бактериальной клетки негенную теорию адаптации к лекарственным препаратам. Хиншельвуд считал, что в тех немногих устойчивых бактериях, которые пережили воздействие лекарственного препарата, это лекарство вызвало сдвиг равновесного состояния метаболических реакций с обычного уровня на новый, уже менее подверженный влиянию этого препарата. Книга Хиншельвуда вышла в свет в 946 г., через три года после того, как Лурия и Дельбрюк уже показали спонтанное происхождение устойчивых к фагу мутантов бактерий. Поэтому казалось бы естественным сделать допущение, что наблюдаемое у бактерий изменение от чувствительности к лекарственному препарату к устойчивости также возникает в результате спонтанного мутирования небольшой части популяции чувствительных к лекарству бактерий. В присутствии лекарственного препарата происходит, по-видимому, жесткий отбор таких устойчивых мутантов, так как они могут расти в этих условиях, тогда как все чувствительные клетки дикого типа погибают. Но на Хиншельвуда флуктуационный тест не произвел впечатления, и он опубликовал несколько правдоподобных критических разборов его интерпретации. Он был настолько уверен в правильности своей кинетической теории адаптации, что даже уже в 1953 г. писал Путем, подобным тому, который предполагается рассматриваемой [кинетической] моделью, адаптационные изменения должны происходить настолько легко, что если бы это было не так, то трудно было бы уклониться от вопроса, почему это не так . Авторитет Хиншельвуда в области химической кинетики придавал вес его взглядам, и это, вероятно, на несколько лет задержало развитие генетики бактерий на его родине, в Великобритании. [c.148]

Такое ступенчатое развитие устойчивости к пенициллину свидетельствует, казалось бы, о действии процесса обучения , индуцируемого пенициллином. Однако вскоре с помощью флуктуационного теста, опытов по пересеву и метода отпечатков было показано, что устойчивость к пенициллину возникает, как и устойчивость к фагу Т1, в результате спонтанного мутирования. В 1948 г. М. Демерец объяснил, почему устойчивая мутантная бактерия может помнить ту концентрацию пенициллина, при которой она была отобрана. Демерец опирался при этом на спонтанное происхождение этого мутантного признака и на то, что пенициллин не играет никакой роли в индуцировании устойчивости к этому антибиоти- [c.149]

Демерец исследовал также механизм приобретения мутантами бактерий устойчивости к стрептомицину (фиг. 69). С помощью флуктуационного теста ему удалось показать, что устойчивые к стрептомицину мутанты Str Е. соН возникают спонтанно. Однако в отличие от пенициллина стрептомицин не дает ступенчатого обучения . Если на чашку с агаром, содержащим 100 мкг/мл стрептомицина, высеять чувствительную к стрептомицину культуру Е. oli Str , то на такой чашке могут образоваться колонии лишь около 1 бактерии из 10 высеянных. Если затем выделить клетки из некоторых из этих немногих выживших колоний, размножить их и высеять бактерии таких изолятов первой ступени на ряд чашек, содержащих возрастающие концентрации стрептомицина, то среди этих бактерий выявится по крайней мере три разных класса мутантов Str. Это будут а) мутанты с низкой устойчивостью, способные выдержать лишь 100 мкг/мл стрептомицина, т. е. ту концентрацию антибиотика, при которой они отбирались, и погибающие при более высоких концентрациях стрептомицина б) мутанты с промежуточной устойчивостью, которые могут выдержать до 500 мкг/мл стрептомицина в) мутанты с высокой устойчивостью, которые могут выдержать еще более высокие концентрации стрептомицина на чашке. При одной ступени отбора на 100 мкг/мл стрептомицина все эти три типа мутантов появляются примерно с одинаковой частотой. Поэтому Демерец сделал вывод, что признак Str контролируется тремя или большим количеством бактериальных генов sir, обладающих разной силой действия, причем частоты мутирования каждого из этих генов примерно одинаковы и составляют 10 мутаций на одну клетку на генерацию. Мутация в любом из этн х генов приводит [c.150]

Раскрыв общую природу скрещивания Hfr х F", Вольман и Жакоб приступили к выяснению вопроса, каким образом возникают генетические рекомбинанты в классических скрещиваниях F" " X F . Объясняется ли очень низкая частота рекомбинации, достигающая в этих скрещиваниях частоты 10 на родительские клетки, тем, что каждая F -клет-ка способна переносить с небольшой, но равной вероятностью любой определенный участок своего генома в F -клетку при их столкновении Или же Р+-клетка вообще неспособна переносить никакой генетический материал, кроме своего полового фактора F, а рекомбинанты фактически образуются благодаря незначительному количествуТразличных Hfr-мутантов, спрятанных в F-популяции, причем каждый Hfr-мутант способен переносить с высокой эффективностью какой-то ограниченный участок генома Е. соИ7 Постановка этой проблемы в виде таких двух альтернатив делает ее формально аналогичной проблеме спонтанного или индуцированного происхождения бактериальных мутантов, обсуждавшейся в гл. VI, и, следовательно, для решения ее также может быть использован флуктуационный тест Лурия — Дельбрюка. [c.227]

Для выполнения этого теста штамм AF Mef высевали в очень незначительной концентрации (250 клеток/мл) в минимальную среду, содержащую ограниченные количества метионина. Половину этой суспензии делили на 50 небольншх частей и как эти части, так и остающуюся другую половину культуры инкубировали до тех пор, пока не истощался метионин и плотность во всех культурах не достигала примерно 2-10 клеток/мл. Содержимое каждой индивидуальной культуры, а также 50-кратное количество общей культуры смешивали с избытком бактерий из культуры штамма ВР Thr" Leu Str и производили отбор рекомбинантов Thr+ Leu" Str в каждом из этих 100 скрещиваний при высеве на минимальный агар, содержащий метионин и стрептомицин. Общин результат такого флуктуационного теста представлен в табл. 15. Можно [c.228]

Доказав с помощью флуктуационного теста, что за плодовитость скрещиваний Р+ X Р" ответственны спонтанные Н1г- мутации , возникающие в р+-популяции, Вольман и Жакоб повторили уже предпринимав-щуюся ранее попытку обнаружить спонтанные мутанты, а именно использовали разработанный Ледербергом метод отпечатков для непосредственного выделения мутантов. С этой целью исходную чашку, содержащую полноценную среду, засевали достаточным числом клеток ауксотрофной Р+-культуры для образования сплошного газона бактерий. Затем [c.228]

Сборник, включающий описание экспериментов с бактериями, бактериофагами и грибами рода Aspergillus-, основу сборника составляют лекции, прочитанные в Хаммерсмитской клинике Лондона (Англия). Описываемые эксперименты охватывают щирокую область исследований — от флуктуационного теста с фагами до генетического картирования организмов рода Aspergillus. Составлен по пунктам в стиле лабораторного руководства. [c.62]

У Е. соН выделено множество штаммов типа Hfr с различными точками начала переноса и различными направлениями хромосомного переноса [13, 27]. Выбор штамма Hfr, таким образом, зависит от участка бактериальной хромосомы, который собираются изучать в отношении картирования генетических локусов. Новые Hfr-доноры могут быть легко выделены на различном генетическом фоне с использованием либо модифицированного флуктуационного теста со штаммом F+ [6], либо интегративной супрессии в штамме F+ или R+, имеющем мутацию dnaA (Ts) [30]. Методы осуществления скрещиваний типа HfrXF" можно проиллюстрировать, используя какой-либо Hfr-штамм, например прототрофный штамм 12 (табл. 14.1), который передает свою хромосому 0-thr leu pro А la ... руг В F и чувствителен к налидиксовой кислоте и стрептомицину, и какой-нибудь штамм F", например штамм 14 (табл. 14.1), с мутациями, обусловливающими ауксотрофность по лейцину, пролину, аденину, триптофану и тиамину и устойчивость к налидиксовой кислоте и стрептомицину. У штамма 14 имеются и другие мутации, и наследование их аллелей дикого типа будет происходить как наследование маркеров, по которым не ведется отбор. Штамм 13 (табл. 14.1) несет меньше мутаций, чем штамм 14 он более удобен для проверки стабильности Hfr-фенотипа в штамме 12. [c.110]

Рис. 5.27. Иллюстрация принципа, положенного в основу флуктуационного теста Луриа и Дельбрюка [1538]. Если клеточное деление носит дихотомический характер, в первом поколении после начала деления будет 2 = = 2 клетки во втором-2 =4 клетки в третьем поколении 2 = 8 клеток и т. д. Если все изучаемые культуры клеток берут начало от одной-единственной клетки и если частоты мутаций одинаковы во всех клеточных поколениях, можно рассчитать относительное число культур с О, 1,2,... мутантными клетками, зависящее от того, в каком клеточном поко-

Справочник химика 21

Химия и химическая технология